MgCl2 có ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả của phản ứng PCR vì Mg2+ tự do có khả
năng kích hoạt enzyme polymerase. Nếu nồng độ Mg2+ hợp lý sẽ làm cho phản
ứng PCR hiệu quả hơn (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Vì vậy thành phần tiếp theo được khảo sát là MgCl2. Nồng độ ion Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào loại taq ADN polymerase, ADN khuôn và thành phần buffer. Nồng
độ MgCl2 được dò tìm bằng cách thử với các nồng độ từ 0,5 đến 5,0 mM, các khoảng cách mỗi bước là 0,5 mM với mẫu có cường độ nhiễm trung bình.
Kết quả cho thấy (hình 4.6) ở nồng độ 0,5 mM không ra kết quả. Nồng độ 1,0 mM ra kết quả không tốt. Có thể do ở nồng độ 0,5 và 1,0 mM không đủ để xúc tác phản ứng, sản phẩm PCR tạo ra ít nên không thấy được sản phẩm khuếch đại khi điện di. Còn ở nồng độ từ 1,5 đến 5,0 mM đều ra kết quả. Những mẫu có nồng độ là 1,5; 2,0 mM ra kết quả các vạch sáng tương đương nhau và không có sản phẩm phụ. Còn ở nồng độ là 2,5 mM là hiện vạch sáng nhất. Nhưng để tiết kiệm hóa chất thì chọn nồng độ MgCl2 là 1,5mM vì ở nồng độ này mẫu cũng ra kết quả tốt. Ở nồng độ 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 mM xuất hiện các sản phẩm phụ.
1 2 3 M
Hình 4.5 Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ MgCl2 Giếng 1: nồng độ MgCl2 0,5mM Giếng 6: nồng độ MgCl2 3,0mM Giếng 2: nồng độ MgCl2 1,0mM Giếng 7: nồng độ MgCl2 3,5mM Giếng 3: nồng độ MgCl2 1,5mM Giếng 8: nồng độ MgCl2 4,0mM Giếng 4: nồng độ MgCl2 2,0mM Giếng 9: nồng độ MgCl2 4,5mM Giếng M: Thang ADN 1kb Giếng 10: nồng độ MgCl2 5,0mM Giếng 5: nồng độ MgCl2 2,5mM
Nhưng khi sử dụng nồng độ này để kiểm tra với mẫu có cường độ nhiễm nhẹ thì mẫu này vẫn không ra kết quả. Do đó, nồng độ MgCl2 vẫn được giữ là 1,5mM. Như vậy có thể nồng độ MgCl2 không là nguyên nhân làm cho mẫu có cường độ
nhiễm nhẹ không ra kết quả.
Sau khi khảo sát nồng độ MgCl2 mẫu có cường độ nhiễm nhẹ vẫn không ra kết qủa. Vì vậy, cần phải tiếp tục khảo sát các thành phần phản ứng khác để có thể
phát hiện được những mẫu có cương độ nhiễm nhẹ. Trong phản ứng PCR, taq ADN polymerase là một trong những thành phần quan trọng nhất. Taq ADN polymerase càng mạnh thì phản ứng PCR càng triệt để (Khuất Hữu Thanh, 2003) Vì thế thành phần phản ứng tiếp theo được xem xét là nồng độ taq ADN polymerase.