Hoạt tính gây độc tế bào

2.4.2.a. Thiết bị nghiên cứu

Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170); Tủ cấy an toàn sinh học cấp II; Máy li tâm (Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -250C,-800C; Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa Kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nito lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.

2.4.2.b. Các dòng tế bào

Các dòng tế bào ung thư của người được cung cấp bởi ATCC gồm. KB

(Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào ; Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan; LU (Human lung carcinoma) – ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.

2.4.2.c. Phương pháp

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NIC) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro [20], [51].

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.

Thử độc tế bào. 200l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bào HepG2, MCF7, KB, LU. Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt nồng độ cuối cùng là 128 g/ml; 32g/ml; 8g/ml; 2g/ml; 0,5g/ml. Ủ 370C, 5% CO2 3 ngày. Giếng điều khiển (đối chứng dương) chỉ gồm 200 l dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml. Ellipticine (Sigma) được dùng làm chất tham khảo (đối chứng âm).

Sau 3 ngày nuôi cấy; ủ tiếp với MTT 0,2 mg/ml ở 370C trong 4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.

Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau.

OD mẫu thử - OD control (+) IC(%) = 100 x ______________________ OD control(-) – OD control (+)

Giá trị IC50 được tính dựa trên số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mền máy tính table curve.

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. THU MẪU THỰC VẬT VÀ XỬ LÝ MẪU

Mẫu cây Bần chua (Sonneratia caseolaris) được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50oC, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột thu được 5 kg bột khô. Sau đó được tiến hành chiết tổng bằng MeOH trên thiết bị chiết siêu âm thu được 570 g cặn chiết MeOH thô. Tiếp đó, ta hòa vào nước cất và chiết phân bố lần lượt với n_Hexan, chloroform và etyl axetat theo tỷ lệ 1/1, thu được các cặn chiết tương ứng từ đó.

Hình 4. sơ đồ chiết phân đoạn dịch chiết methanol của cây Bần chua BCC. CặnCHCl3(22.5 g)

Bổ sung EtOAc

Bột lá khô Sonneratia caseolaris

Chiết MeOH BC- Cặn MeOH (570g) Bổ sung nước N-Hexan. nước 1/1 BCE. Cặn EtOAc (9.3 g) EtOAc. nước 1/1 BCW. Lớp nước Bổ sung CHCl3 BCH. CặnN-Hexan (22.5 g) CHCl3. nước 1/1 Bổ sung N-Hexan Lớp nước Lớp nước

3.2. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

Hình 5. sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn BCW3

Phần dịch nước tiến hành chạy dianion theo tỉ lệ MW 0/100-100/0 thu được 3 phần BCW1, BCW2, BCW3. Phân đoạn BCW3 tiến hành phân tách thô thành 4 phân đoạn BCW3.1 đến BCW3.4 bằng sắc kí cột silica gel sephadex với hệ dung môi rửa giải MW 1/1.

Từ phân đoạn BCW3.1 tiến hành chạy sắc kí cột silicagel thường hệ dung môi rửa giải là EMW 15/1/0.1 thu được phân đoạn từ W3.1A đến W3.1D. Từ phân đoạn W3.1B (350mg) chạy sắc kí cột pha thường sử dụng hệ dung môi DAM 2/1/0.1 thu được hai phân đoạn nhỏ hơn lần lượt là W3.1B1 và W3.1B2. Hợp chất BCW1 (30mg) thu được từ phân đoạn W3.1B1 bằng cách chạy sắc kí cột sử dụng hạt YMC với hệ dung môi MW 1/1. Từ phân đoạn W3.1B2 (100 mg) phân tách được hai hợp chất

Phần rửa 100% MeOH (BCW3) BCW3.1 (1,3g) BCW3.3 BCW3.4 BCW3.2 (1,3g) W3.1A W3.1B (350mg) W3.1C W3.1D (116mg) W3.1B2 (350mg) W3.1B2 (350mg) BCW1 (30mg) BCW7 (5mg) W3.1D1 (30mg) W3.1D2 (35mg) BCW5 (7mg) BCW6 (5mg) BCW9 (5mg) W3.2A W3.2B (350mg) W3.2C BCW2 (7mg) BCW4 (5mg) W3.2C1 (100mg) W3.2C 2 W3.2A (300mg) W3.2B W3.2C (400mg) BCW3 (15mg) CC, Sephadex LH-20 MW 1.1 CC, Silicagel DMW 5.1.0.1 CC, Silicagel EMW 15.1.0.1 CC, Silicagel DAM 2.1.0.1 CC, Sephadex MW 1.1 CC, YMC RP18 MW 1.4 CC, Silicagel EMW 20.1.0.2 CC, DMW 3.1.0.1 CC, Sephadex MW 1.1 CC, YMC RP18 MW 1.1 CC, Sephadex MW 1.1

BCW 7 (5mg) và BCW 8 (3mg) bằng cách tiến hành sắc kí cột sử dụng hạt sephadex với hệ dung môi MW 1/1.

Từ phân đoạn W3.1D (116mg) chạy sắc kí cột sephadex sử dụng hệ dung môi MW 1/1 thu được phân đoạn là W3.1D1 và W3.1D2. Từ phân đoạn W3.1D2 (35mg) sử dụng sắc kí bản mỏng hệ dung môi DMW 2/1/0.1 thu được hai hợp chất là BCW5

(7mg) và BCW6 (5mg). Hợp chất BCW9 (5mg) thu được từ phân đoạn W3.1D1 (30mg) với hệ dung môi DMW 3/1/0.1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Tiến hành sắc kí cột pha thường với phân đoạn BCW3.2 (1.6g) sử dụng hệ dung môi DMW 5/1/0.1 thu được 3 phân đoạn W3.2A, W3.2B và W3.2C. Từ phân đoạn W3.2A (mg) tiếp tục chạy sắc kí cột sephadex với hệ dung môi rửa giải MW 1/1 thu được 3 phân đoạn W3.2A1, W3.2A2 và W3.2A3. Hợp chất BCW2 (7mg) và hợp chất BCW4 (5mg) thu được từ phân đoạn W3.2A2 (56mg) bằng cách sử dụng sắc kí cột với hạt silica gel thường hệ dung môi EMW 20/1/0.2 .

Từ phân đoạn W3.2C (400mg) chạy sắc kí cột sephadex với hệ dung môi MW 1/1 thu được 2 phân đoạn W3.2C1 và W3.2C2. từ phân đoạn W3.2C1 (100mg) chạy sắc kí cột YMC RP18 hệ dung môi MW 1/4 thu được hợp chất BCW3 (15mg).

3.3. CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP 3.3.1. Hợp chất BCW1

Hình 6. phổ 1H-NMR của BCW1

Hợp chất BCW1 phân lập được từ phân đoạn dịch chiết nước của cây bần chua, có dạng dầu, không màu. Phổ 1H NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 4 nhóm methyl, trong đó có 3 nhóm methyl bậc ba tại δH 1.02 (3H, s), 1.05 (3H, s), 1.95 (3H, s) và một nhóm methyl bậc hai tại δH1.31 dưới dạng tín hiệu doublet (J = 6.5 Hz). Vùng trường yếu có tín hiệu của 2 proton olefin tại tại δH 5.67 (1H, dd, 9.0, 15.5 Hz), 5.79 (1H, dd, 6.5, 15.5 Hz) thuộc một liên kết π cấu hình trans và một liên kết π khác thế ba lần với tín hiệu cộng hưởng tại δH 5.90 (1H, s). Ngoài ra trên phổ này còn có các tín hiệu của 1 nhóm CH2 tại δH 2.07 (1H, d, 17.0)/2.45 (1H, d, 17.0), một nhóm oximethine tại δH 4.42 (1H, t, 6.5 Hz) và 1 proton anome thuộc 1 gốc đường glucose cấu hình β cho tín hiệu doublet tại δH 4.38 với hằng số tương tác J = 7.5 Hz. Những tín hiệu nhận dạng trên phổ này gợi ý cho thấy đây có thể là một hợp chất megastigman glycoside 1 đơn vị đường.

Phổ 13C NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu của 19 carbon, kết hợp với việc phân tích phổ cộng hưởng từ 2 chiều HSQC cho phép nhận dạng các tín hiệu gồm 1 nhóm carbonyl δC 201.97, 1 liên kết π dạng -CH=C< với δC 126.12/165.97, một liên kết π nữa dạng -CH=CH- với δC 128.79/138.19, một nhóm oximethine δC 76.94, một nhóm CH2 δC 48.48, hai carbon bậc bốn δC 37.08, δC 56.73, bốn nhóm methyl δC 21.03, δC 27.55, δC 28.05, δC 23.74 và 6 tín hiệu của gốc đường glucose tại δC 102.42, δC 75.22, δC 78.06, δC 71.48, δC 77.92, δC 62.67.

35 Hình 8. phổ HSQC của BCW1 Hình 9. cấu trúc của BCW1 Bảng 10. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW1 Vị trí #δCa[5] δCa,b δHa,c (J = Hz) HMBC 1 37.1 37.08 - 2 nd 48.48 2.07 (1H, d, 17.0) 2.45 (1H, d, 17.0) 1, 3, 11, 12 3 202.0 201.97 - 4 126.2 126.12 5.90 (1H, s) 2, 6, 13 5 165.8 165.79 - 6 56.8 56.73 2.69 (1H, d, 9.0) 4, 5, 7, 8 7 128.8 128.79 5.67 (1H, dd, 9.0, 15.5) 5, 6, 8, 9 8 138.3 138.19 5.79 (1H, dd, 6.5, 15.5) 6, 9, 10 9 77.0 76.94 4.42 (1H, t, 6.5) 7, 8, 10, 1' 10 21.0 21.03 1.31 (3H, d, 6.5) 9 11 27.6 27.55 1.02 (3H, s) 1, 2, 6, 12

36 12 28.1 28.05 1.05 (3H, s) 1, 2, 6, 11 13 23.8 23.74 1.95 (3H, br s) 4, 5, 6 1' 102.5 102.42 4.38 (1H, d, 7.5) 9 2' 75.3 75.22 3.20 (1H, t, 8.2) 3' 78.1 78.06 3.36 (1H, t, 8.7) 4' 71.6 71.48 3.32 (1H, m) 5' 78.0 77.92 3.24 (1H, m) 6' 62.7 62.67 3.68 (1H, dd, 5.5, 12.0) 3.84 (1H, dd, 2.5, 12.0)

a đo trong CD3OD, b 125MHz, c 500MHz

#δC .Số liệu phổ theo chất (6R, 9R)-3-oxo-α-ionol-β-D-glucopyranoside, tài liệu số

[5]

Với những tín hiệu nhận biết nói trên, BCW1 được xác định là một hợp chất megastigman glycoside. So sánh với dữ liệu phổ trong các tài liệu đã công bố [5], hợp chất này được nhận dạng là (6R, 9R)-3-oxo-α-ionol β-D-glucopyranoside, với công thức phân tử là C19H30O7. Kết luận này còn được khẳng định thêm bằng các tương tác xa trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HMBC (hình 9). Các tương tác giữa H-11 và H-12 với C-1, C-2, C-6 và tương tác giữa H-11 với C-12, giữa H-12 với C- 11 cho thấy 2 nhóm methyl này liên kết vào vị trí C-1. Tương tác giữa H-13 với C-4, C-5, C-6 chỉ ra nhóm methyl này gắn với C-5. Nhánh bên isobutenyl được xác định liên kết vào vị trí C-6 bởi các tương tác giữa H-7 với C-5, C-6, C-8, C-9, giữa H-8 với C-6, C-9, C-10, giữa H-9 với C-7, C-8, C-10, giữa H-10 với C-8, C-9. Cuối cùng, gốc đường glucose gắn vào vị trí C-9 với các tương tác giữa H-1’’ với C-9 và H-9 với C-1’’.

Hình 11. phổ HMBC của BCW1 3.2.2. Hợp chất BCW2

Hợp chất BCW2 phân lập được từ phân đoạn dịch chiết nước của mẫu cây bần chua, có dạng tinh thể màu trắng, điểm chảy 1610C. Phổ 1H-NMR của BCW2 có dạng một phenyl glycoside. Trên vùng trường yếu có tín hiệu của 2 proton thơm ở vị trí meta với nhau trên 1 vòng thơm 4 lần thế, cộng hưởng tại 6.14 (1H, d, 2.0) và 6.21 (1H, d, 2.0). Vùng trường mạnh có các tín hiệu của một nhóm methoxy tại 3.86 (3H, s) và một nhóm methyl tại 2.55 (3H, s) cho thấy sự có mặt của 1 nhóm acetyl trong phân tử. Ngoài ra trong phân tử này còn 1 gốc đường glucose cấu hình β với proton anome cộng hưởng tại 4.98 (1H, d, 7.5) và các proton đường trong vùng từ 3.14 – 3.69 ppm.

Hình 12. phổ 1H-NMR của BCW2

Phổ 13C-NMR cho tín hiệu của 15 carbon, trong đó có 1 nhóm carbonyl tại 203.36 ppm, 6 carbon thơm trong khoảng từ 92 – 165 ppm, 1 nhóm methyl bâc ba tại 33.14 ppm, một nhóm methoxy tại 56.42 ppm, một carbon anome điển hình tại 99.98 ppm và các carbon đường trong khoảng từ 61 – 78 ppm.

Hình 14. phổ HSQC của BCW2

Phân tích chi tiết các tín hiệu trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HSQC cho thấy dữ liệu phổ của BCW2 (bảng 11) hoàn toàn phù hợp với hợp chất

annphenone hay 4-Acetyl-3-hydroxy-5-methoxyphenyl β-D-glucopyranoside[4], một phenylglycoside phân lập từ loài artemisia annua năm 1997 với công thức phân tử C15H20O9. Bảng 11. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW2 TT #δCa,b[4] δCc,d δHc,e (J = Hz) HMBC (H → C) 1 106.78 106.76 2 163.55 165.67 3 96.06 96.54 6.14 (1H, d, 2.0) 1; 2; 4; 5 4 164.63 164.04 5 92.12 92.33 6.21 (1H, d, 2.0) 1; 3; 4; 6 6 163.28 163.00 7 205.72 203.36 8 32.33 33.14 2.55 (3H, s) 1; 7 6-OMe 55.61 56.42 3.86 (3H, s) 6 1’ 99.18 99.98 4.98 (1H, d, 7.5) 4 2’ 72.75 73.45 3.24 (1H, t, 8.5) 1’; 3’ 3’ 76.35 76.91 3.29 (1H, t, 8.8) 2’; 4’ 4’ 69.44 70.10 3.14 (1H, t, 9.0) 6’; 5’ 5’ 75.54 77.66 3.40 (1H, m) 1’; 3’; 6’ 6’ 60.59 61.05 3.45 (1H, dd, 6.0; 11.5) 3.69 (1H, br d, 11.5) 5’

a Đo trong D2O; b100 MHz; c Đo trong DMSO-d6, d 125 MHz, e 500 MHz.

Trật tự các vị trí và các nhóm thế trong phân tử BCW2 cũng được xác nhận trên phổ HMBC (bảng 11và hình 13). Các tương tác xa giữa proton 6-OMe với C-6, giữa H-8 với C-1 và C-7 cho thấy nhóm methoxy liên kết vào C-6 và nhóm acetyl gắn vào C-1. Tương tự tương tác giữa H-1’ với C-4 khẳng định gốc đường glucose liên kết với C-4.

Hình 16. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW2

Hình 17. phổ HMBC của BCW2 3.2.3. Hợp chất BCW3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Hợp chất BCW3 phân lập được từ phân đoạn dịch chiết nước của mẫu cây Bần chua, có dạng bột vô định hình màu vàng. Phổ 1H-NMR của hợp chất này ở vùng trường yếu có các tín hiệu hệ ABX của 3 proton thơm thuộc một vòng benzen A cộng hưởng tại 6.81 (1H, d, 2.0); 6.76 (1H, d, 8.0); 6.65 (1H, dd, 2.0; 8.0) và 2 proton thơm

khác thuộc một vòng benzen B thế 4 lần xuất hiện tại 6.66 (1H, s) và 6.20 (1H, s). Sự có mặt của một gốc đường cấu hình β trong phân tử cũng được xác nhận với tín hiệu của 1 proton anome tại 4.14 (1H, d, 8.0). Ngoài ra phổ này còn cho tín hiệu của 2 nhóm methoxy cộng hưởng tại 3.81 (3H, s); 3.82 (3H, s), 3 nhóm methine tại 4.08 (1H, m), 2.10 (1H, m); 1.88 (1H, m), 2 nhóm oxymethylene tại 3,74 (2H, dd, 6,0; 11,0), 3,23 (1H, m) – 4,07 (1H, m), và 1 nhóm metilen tại 2.83 (1H, m) ppm.

Hình 18. cấu trúc của BCW3

Phổ 13C-NMR của hợp chất này có mặt 26 carbon, trong đó có 12 carbon thơm trong vùng từ 112 – 149 ppm, 2 nhóm methoxy tại 56.40; 56.49 ppm, 2 nhóm oximetilen tại 65.23, 69.56 ppm, ba nhóm metin tại 47.9; 45.9; 39.57 ppm, 1 nhóm metinlen tại 33.85 ppm, 1 carbon anome tại 105.18 và 5 carbon gắn oxi của đường trong vùng từ 62 – 78 ppm.

Hình 21. phổ HSQC của BCW3

Với những tín hiệu thu được từ các phổ 1 chiều nói trên, hợp chất này được nhận định là một lignan glycoside. Độ chuyển dịch hóa học của từng proton đã được gán với các carbon tương ứng nhờ phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HSQC (bảng 12). Trên phổ HMBC tương tác giữa các nhóm methoxy 7-OMe với C-7, 3’-OMe với C-3’ khẳng định vị trí các nhóm thế này trên các vòng thơm. Trật tự vị trí các nhánh propyl của lignan này cũng được xác định nhờ các tương tác xa giữa H-1 với C-2, C- 3, C-2a, C8, C-9, C-10 và giữa H-4 với C-5, C-9, C-10, C-3, C-3a, C1’, C-2’, C-6’. Vị trí của gốc đường glucose cũng được xác định nhờ các tương tác của proton anome H-1’’ với C-3a và H-3a với C-1’’. Từ những dấu hiệu nhận dạng nêu trên cùng với sự phù hợp hoàn toàn về dữ liệu phổ NMR của BCW3 với các số liệu đã được công bố [22] cho phép khẳng định cấu trúc hóa học của hợp chất này là (+)-isolariciresinol- 3a-O-β-glucopyranoside, với công thức phân tử là C26H34O11.

Hình 23. một số tương tác HMBC quan trọng của BCW3 Bảng 12. dữ liệu phổ NMR của hợp chất BCW3 Vị trí #δCa δCa,b δHa,c (J= Hz) HMBC 1 33.9 33,85 2,83 (2H, m) 2, 3, 2a, 8, 9, 10 2 39.5 39,57 2,10 (1H, m) 2a 65.2 65,23 3,74 (2H, dd, 6,0; 11,0) 1 3 45.9 45,9 1,88 (1H, m) 1, 2, 4, 1’ 3a 69.5 69,56 3,23* (1H) – 4,07* (1H) 1’’, 2, 3, 4 47.3 47,90 4,08* (1H) 3, 3a, 5, 9, 10, 1’ 2', 6' 5 117.4 117,38 6,20 (1H, s) 4, 6, 7, 9 6 145.8 145,14 -

46 7 147.1 147,13 - 8 112.4 112,43 6,66 (1H, s) 10, 6, 7, 1 9 129.1 129,48 - 10 134.4 134,39 - 1' 138.7 138,64 - 2' 114.3 114,36 6,81 (1H, d, 2,0) 4', 6' 3' 148.9 148,90 - 4' 145.1 145,84 - 5' 116.1 116,09 6,76 (1H, d, 8,0) 1', 3' 6' 123.1 123,13 6,65 (1H, dd, 2,0; 8,0) 2', 4' 1'' 105.2 105,18 4,14 (1H, d, 8,0) 3a, 3'', 5'' 2'' 75.0 75,19 3,21* (1H,) 4'' 3'' 77.9 77,85 3,20* (1H) 5'' 4'' 71.4 71,67 3,28* (1H) 6'' 5'' 78.2 78,13 3,34 (1H, m) 3'' 6'' 62.5 62,77 3,63* (1H) – 3,83 (1H) 4'' 7-OMe 56.4 56,40 3,81 (3H, s) 7 3'-OMe 56.5 56,49 3,82 (3H, s) 3'

a đo trong CD3 OD, b 125MHz, c 500MHz

# Số liệu phổ của (+)-Isolariciresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside tài liệu [22], * tín hiệu bị chồng lấp

3.3.4. Hợp chất BCW4

Hình 24. phổ 1H-NMR của BCW4

Hợp chất BCW4 phân lập được từ phân đoạn dịch chiết nước của mẫu cây Bần chua, có dạng dầu màu vàng. Tương tự hợp chất BCW3, các phổ NMR của hợp

Mục lục