Các loài Sonneratia nói chung và cây Bần chua (Sonneratia caseolaris) đều là các cây thuốc quý, chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đáng quan tâm.
Hoạt tính gây độc tế bào.
Trong một nghiên cứu chỉ ra hợp chất (-)-R-nyasol, (-)-R-4-O-methylnyasol và maslinic acid trong cây Bần chua chịu trách nhiệm về hoạt động gây độc tế bào [10].
Hoạt tính chống oxy hóa và khả năng giảm đau.
Năm 2003, nghiên cứu của Nuntavan Bunyapraphatsara và cộng sự cho kết quả trong 52 mẫu của 32 loài thử nghiệm, đài hoa của S.caseolaris có hoạt tính chống
17
oxy hóa mạnh mẽ, tiếp theo là đến nhị của loài này. Thành phần của đài hoa và nhị hoa của Bần chua chứa peroxy chống lipit cao [42].
Năm 2012, tác giả Md. Sariful và cộng sự tiếp tục nghiên cứu kĩ khả năng chống oxy hoá của dịch chiết ethanol từ lá cây S.caseolaris cho thấy khả năng giảm đau và chống oxy hoá hiệu quả và chứng minh nó sử dụng trong phương thuốc dân gian. Kết quả cho thấy dịch chiết thô sản xuất 24,37 % giảm đau với liều 250 mg/kg trọng lượng cơ thể và 43,15 % giảm đau với liều lượng 500 mg/kg trọng lượng cơ thể trong khi thuốc tiêu chuẩn ức chế diclofenac Na 65.48 % với liều 25 mg/kg trọng lượng cơ thể [38].
Bảng 3. ảnh hưởng của dịch chiết ethanol từ lá S.caseolaris đối với khả năng giảm đau ở chuột.
Sử dụng DPPH trên TLC quan sát dưới tia cực tím phát hiện trong cả hai bước sóng 254 nm và 360 nm. Thành phần chất chống oxy hóa trong dịch chiết ethanol của
S.caseolaris đã được xác định, chiết xuất gây ra sự gia tăng trong hoạt động DPPH gốc tự do oxy hoá (% ức chế) như tăng liều, cho thấy hoạt động chống oxy hóa tiềm năng IC50 là 68 ± 0,82 mg ml-1 (p <0,001), so với của acid ascorbic (IC50 13 ± 0,21 mg ml-1) (P <0.001) là một chất chống oxy hóa nổi tiếng (Bảng 4, Hình 1).
18
Bảng 4. so sánh phần trăm ức chế và IC50 của dịch chiết thô lá cây Bần chua với ascorbic acid
Hình 1. biểu đồ thể hiện hoạt tính chống oxy hóa của Bần chua và ascorbic acid
Cũng theo hướng nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của cây Bần chua, năm 2013, nhóm tác giả P. Wetwitayaklung và cộng sự đã nghiên cứu và tìm kiếm hoạt tính dược lý của các phân đoạn dịch chiết khác nhau từ các bộ phận của loài cây này. Kết quả cho thấy khả năng chống oxy hóa của dịch chiết methanol của đài bằng phương pháp ngâm và dịch chiết methanol của nhị hoa bằng phương pháp Soxhlet là vừa phải. Cho xét nghiệm chất chống oxy hoá giảm sắt, tất cả dịch chiết cho hoạt tính chất chống oxy hoá thấp. Dịch chiết nhụy và dịch chiết hạt bằng phương pháp ngâm chiết methanol cho thấy ức chế không cạnh tranh trên hoạt tính acetylcholinesterase. Trong khi, luteolin, luteolin glycoside và dịch chiết đài và dịch chiết hạt bằng cách đun sôi nước biểu hiện ức chế cạnh tranh từng phần trên hoạt tính acetylcholinesterase [43].
Trong một bài báo khác của tác giả Bishwajit Bokshi và cộng sự năm 2013, thử nghiệm sàng lọc hoạt tính giảm đau của Sonneratia caseolaris của dịch chiết thô ethanol của lá và thân cây Bần chua thu được có hoạt tính khác nhau [13]. Các tác giả
19
cũng sử dụng mô hình thí nghiệm dùng acetic acid gây đau đớn ở chuột (Whittle, 1964; Ahmed et al.,2004) [13]. Kết quả cho thấy chuột trong nhóm tiêu chuẩn có khả năng giảm đau 67% so với nhóm kiểm soát. Dịch chiết ethyl acetate của thân (EACS) và dịch chiết chloroform của lá (CFCL) cho thấy hoạt động giảm đau 33%, và 17% ở liều 250 mg/kg tương ứng 50% và 54% ở 500 mg/kg liều tương ứng (Bảng 5 và 6).
Bảng 5. hoạt động giảm đau của phân đoạn chiết khác nhau của thân và lá
S.caseolaris đối với acid acetic gây ra đau đớn ở chuột.
Bảng 6. đánh giá thống kê
Hoạt tính trị tiêu chảy.
Cũng theo công bố của nhóm tác giả Bishwajit Bokshi và cộng sự cho thấy hoạt tính trị tiêu chảy của dịch chiết ethanol các phần khác nhau của cây Bần (Chatterjee, 1993) [13]. Kết quả cho thấy dịch chiết từ cây Bần chua gây ra sự gia tăng trong thời gian tiềm ẩn nghĩa là trì hoãn sự khởi đầu của quá trình bị tiêu chảy và giảm tần suất số lần đại tiện và số phân. Từ kết quả bảng 7 và 8 có thể được kết luận rằng dịch phân đoạn Ethyl Acetate của thân S.caseolaris có ý nghĩa nhất hoạt động trị tiêu chảy.
20
Bảng 7. ảnh hưởng dịch chiết ethyl acetate thân và dịch chiết chloroform lá từ cây Bần chua trên thời gian tiềm ẩn của dầu thầu dầu gây ra tiêu chảy ở chuột.
Bảng 8. ảnh hưởng dịch chiết ethyl acetate thân và dịch chiết chloroform lá từ cây Bần chua trên cơ sở trung bình số lượng phân của chuột do thầu dầu gây ra tiêu chảy.
Hoạt tính kháng khuẩn.
Các nhà khoa học người Thái Lan năm 2012 khi nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của cây Bần chua đã sử dụng ba xét nghiệm dựa trên môi trường thạch khác nhau (SPPD, SWPD, PPD) với dịch chiết methanol từ hạt cây Bần chua và gallic acid đã được thử nghiệm. Kết quả cho thấy dịch chiết này có thể ức chế Staphylococcus aureus và Candida albicans nhưng không ức chế Escherichia coli trong khi acid gallic cho thấy hoạt động chống lại chỉ Staphylococcus aureus. Tất cả phương pháp cho thấy các kết quả của hoạt động kháng khuẩn không khác biệt. Sau đó các chất chiết xuất từ lá, rễ thở và các bộ phận khác nhau của hoa hoặc trái cây (nhị hoa, đài hoa, thịt trái cây và hạt giống) và gallic acid đã được thử nghiệm cho hoạt tính kháng khuẩn sử dụng môi trường SWPD đối với ba loài (Streptococcus mutans, Propionibacterium acnes và các vi khuẩn kỵ khí). Tất cả các chiết xuất thử nghiệm cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống chỉ P. acnes trong khi gallic acid có hoạt tính kháng khuẩn chống lại S. mutans, P. acnes và vi khuẩn kỵ khí [31].
21
Dịch chiết Bần chua có một số hợp chất thuộc các nhóm chất hóa học có hoạt tính cao như: flavonoid, steroid, phenol và tannin hydroquinone, có hoạt tính kháng khuẩn chống lại V. harveyi trong ống nghiệm [40]. Hydroquinone được phân lập từ
S. caseolaris, cho thấy hoạt tính kháng khuẩn [39], [57], kháng nấm [57], chất chống oxy hóa [2], và có khả năng kích thích các tế bào nguyên bạch cầu hạt đại thực bào in vitro và in vivo [23]. Nghiên cứu của tác giả Arifudin và cộng sự đã chứng minh dịch chiết methanol và dịch chiết chloroform từ quả Bần chua có tác dụng chống vi khuẩn để kiểm soát Vibrio harveyi kết quả cho thấy tổng số tôm sống sót cao hơn đối chứng (100% so với 50%). Tổng số của V. harveyi từ tiêm tôm, trước hoặc sau khi thử nghiệm giảm 2,6 l x l04 CFU/g và 1,61 x 104 CFU/g, tương ứng với nồng độ ức chế tối thiểu MIC 3000 ppm [6],[7] . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nghiên cứu năm 2012 của các nhà khoa học người Philippines đã phát hiện trong dịch chiết của lá và cành cây Bần chua trong thức ăn tôm sú có glycosides, steroid, triterpenes, sterol và flavonoid được xác định bởi TLC. Dựa trên thí nghiệm chiết xuất cành cho kết quả hoạt tính kháng khuẩn cao hơn so với các chiết xuất từ lá. Hơn nữa, dịch chiết methanol từ cành cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất và do đó được sử dụng để thử nghiệm thêm. Tôm có chế độ ăn thêm chất chiết xuất từ Bần chua cho kết quả có giá trị cao hơn đáng kể so với đã làm các nhóm kiểm soát củatôm. Không có dấu hiệu ngộ độc hoặc bất kỳ tác dụng phụ thay đổi mô học trong tôm cho ăn khẩu phần thuốc ở 1000 mg ml. [44], [45].
Theo báo cáo gần đây năm 2013 của các tác giả nhóm nghiên cứu Trần Mỹ Linh về đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định đối với dịch chiết từ cành lá của Sonuneratia caseolaris, kết quả đánh giá hoạt tính với vi khuẩn Proteus mirabilis
ATCC®29245™ và Proteus vulgaris ATCC®33420™* cho thấy Sonneratia caseolaris thể hiện hoạt tính ức chế mạnh [56].
22
Bảng 9. kết quả đánh giá hoạt tính của các loài thực vật kiểm định
Giá trị biểu hiện ở các cột. Bán kính vùng ức chế (BK). (-). không có biểu hiện ức chế, vi khuẩn phát triển bình thường. Đối chứng dương. Ampicilin 0,1 mg/ml với
E. coli và P. mirabillis; Kanamycin 5 mg/ml với S. aureus và P. vulgaris. Các giá trị bán kính vùng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật được tính trung bình của ba lần thí nghiệm lặp lại.
Hoạt tính hạ đường huyết.
Năm 2010 trong nghiên cứu của các tác giả người Ấn Độ đã phân lập và xác định được ba hợp chất từ dịch chiết methanol cây Bần chua có hoạt tính sinh học là oleanolic acid, β-sistosterol-β-Dglucopyranoside và luteolin. Trong đó hợp chất oleanolic acid trong thí nghiệm với α-glucosidase ruột chuột cho thấy hoạt tính ức chế mạnh α-glucosidase (IC 50 = 15 mM); tuy nhiên, tiềm năng ức chế của nó giảm mạnh khi α-glucosidase ruột chuột được nuôi cấy với chất nền trước. Trong các nghiên cứu in vivo cũng cho thấy hoạt động chống tăng đường huyết của hợp chất oleanolic acid trong xét nghiệm dung nạp tinh bột. Đây là báo cáo đầu tiên xác định oleanolic acid trong quả S.caseolaris ức chế α-glucosidase của ruột và các hoạt động chống tăng đường huyết [8].
23
Hình 2. biểu đồ cặn chiết và các chất phân lập được từ Bần chua (50mg/ml nồng độ) đối với ức chế hoạt động α-glucosidase của chuột. Dữ liệu đại diện cho có
nghĩa là ±SD của mẫu ba lần.
Trong nghiên cứu khác về hoạt tính chống tăng đường huyết của thân cây
Curcuma zedoaria (Christm.) và quả cây Sonneratia caseolaris cho thấy dịch chiết methanol của cây Bần chua có hiệu quả chống tăng đường huyết [25]. Maslinic acid phân lập từ quả Bần chua [62] đã được chứng minh là có tác dụng ức chế α- glucosidase vừa phải. Các chất chiết xuất có thể tăng tiết insulin của tụy, tăng sự hấp thu glucose từ máu, hoặc giảm hấp thu glucose từ ruột [16], [10]. Kết quả nghiên cứu năm 1979 của các tác giả Anderson và Ward cho thấy quả Bần chua có chứa sợi toeritis có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu và cholesterol [3]. Cung cấp chất xơ 39 g/ngày có thể làm giảm glucose 12 mg/dl trong điều kiện ăn chay và giảm lượng đường trong máu 17 mg/dl các điều kiện sau ăn.
Cũng trong nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết từ dịch chiết methanol của quả Bần chua thu hái từ khu vực Bagerhat, Sundarbans, Bangladesh của tác giả M.N.Hasan và cộng sự tháng 4 năm 2013 đã chứng minh dịch chiết có tác dụng hạ đường huyết và hoạt động trị tiểu đường; cải thiện glucose trong máu bằng gia tăng mẫn cảm insulin đến tế bào hoặc do giảm hấp thu glucose từ đường dạ dày - ruột hoặc
24
do giảm gan tạo đường và sự hủy glucose, giống như thuốc trị bệnh tiểu đường mà không cần insulin. Thành phần cơ bản của trái quả Bần chua có vài các đặc tính có dược tính và có thể dùng cho điều trị bệnh khác nhau [35].
Hoạt tính chống tai biến tim.
Trong nghiên cứu của tác giả R.Ahmed và cộng sự về tác dụng chống tai biến tim trên đối tượng chuột kết quả cho thấy bột lá của Bần chua có tác dụng có lợi về phòng chống tai biến tim. Bột lá cũng làm giảm đáng kể nồng độ đường trong máu ở những con chuột sau khi dùng trong 28 ngày. Do đó thường xuyên của bột lá cũng có thể giúp bệnh nhân tiểu đường trong việc duy trì một mức độ đường trong máu bình thường [49].
25
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. MẪU THỰC VẬT.
Cây Bần chua được thu hái vào tháng 07 năm 2013 tại Vườn Quốc gia Xuân Thủy (Cồn Ngạn) – Giao Thủy – Nam Định. Tọa độ. N. 20.25807; E. 106.57592. Mẫu cây được TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định.
Hình 3. Sonneratia caseolaris (L.) Engl. - Bần chua Ảnh TS. Nguyễn Thế Cường, chụp tại VQG. Xuân Thủy
Mẫu tiêu bản (VAST,ĐTCB-TC5) được lưu giữ tại Viện Hoá Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai
26
bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu.
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo YMC RP-18 (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).
2.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT CHẤT
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa sinh biển.
2.3.2. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR). 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), DEPT135, DEPT90, HSQC và HMBC được đo trên máy Bruker AM5a00 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 2.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 2.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
2.4.1.a. Vật liệu
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các hợp chất thu được theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) [58], và McKane & Kandel (1996) [37].
Các chủng vi sinh vật kiểm định
27
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923 ) - Vi khuẩn Gr (+). Bacillus subtillis (ATCC 11774 )
Staphylococcus aureussubsp. aureus (ATCC 11632) - Nấm mốc. Aspergillus niger (439)
Fusarium oxysporum (M42) - Nấm men . Candida albicans (ATCC 7754)
Saccharomyces cerevisiae (SH 20)
Chứng dương tính
+ Streptomycin cho vi khuẩn Gr(+) + Tetracyclin cho vi khuẩn Gr(-)
+ Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm mốc và nấm men.
Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp. Streptomycin 4 mM; Tetracyclin 10 mM; Nystatin 4 mM.
Chứng âm tính
Vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
- Môi trường duy trì và bảo tồn giống. Saboraud Dextrose Broth (SDB- Sigma) cho nấm men và nấm mốc. Trypcase Soya Broth (TSB-Sigma) cho vi khuẩn.
- Môi trường thí nghiệm. Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.
2.4.1.b. Phương pháp
Chuẩn bị VSVKĐ
Các chủng VSVKĐ được duy trì trong các môi trường. thạch thịt - pepton đối với vi khuẩn; Hanxen đối với nấm men, và Czapek - Dox đối với nấm mốc. Trước khi tiến hành thí nghiệm, các chủng VSVKĐ được hoạt hóa trong các môi trường dinh dưỡng dịch thể. môi trường Eugon Broth cho vi khuẩn và Mycophyl cho nấm (ủ 24 giờ ở 37°C đối với vi khuẩn, 48 giờ ở 30°C đối với nấm), sau đó pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Land (khoảng 108 vi sinh vật/ml).
Chuẩn bị mẫu thử
28 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành thí nghiệm
Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau. Dãy 1. môi trường nuôi VSVKĐ.
Dãy 2. dung môi + huyền dịch VSVKĐ đã được hoạt hóa. Dãy đối 3. huyền dịch VSVKĐ đã được hoạt hóa.
Dãy thí nghiệm. mẫu thử + huyền dịch VSVKĐ đã được hoạt hóa.
Các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37oC/24 cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.
2.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào
2.4.2.a. Thiết bị nghiên cứu
Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170); Tủ cấy an toàn sinh học cấp II; Máy li tâm (Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -250C,-800C; Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa Kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nito lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.
2.4.2.b. Các dòng tế bào