2.2.1.Khảo sát độ tinh khiết của cao Quế và cao Xạ Can 2.2.1.1.Xác định độ ẩm
Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 12.16 [1] Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy
Nguyên tắc
Cao được sấy ở 105oC, nước trong mẫu sẽ bốc hơi làm giảm khối lượng mẫu, cân khối lượng mẫu sau khi sấy sẽ tính được độ ẩm của mẫu cao.
Tiến hành
Cho vào chén cân dùng để xác định độ ẩm, đã được cân bì trước. Chén cân cần có kích thước thích hợp để lớp cao cho vào không dày quá 5mm. Cho chén chứa cao vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100 -1050C trong 4 giờ. Cho chén vào bình hút ẩm đến khi nguội. Làm lại nhiều lần đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0,5mg.
4 12500 10 t c c A X C d A m − × = × × ×
Độ ẩm (X %) của cao được tính theo công thức sau: 100 p a X p − = ×
p: Số gam mẫu thử trước khi sấy (g) a: Số gam mẫu thử sau khi sấy (g) 2.2.1.2.Độ tro toàn phần
Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 9.8[1]
Tiến hành
Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 0,5g cao rải đều vào chén nung, sau đó đốt hết hơi nước của cao trên bếp điện rồi đem nung trong lò nung ở 550oC trong 4 giờ. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung đến khối lượng giữa hai lần cân không quá 5mg. Độ tro toàn phần được tính theo công thức:
100 a X b = × X: Độ tro toàn phần (%)
a: Khối lượng cao sau khi nung(g) b: Khối lượng cao trước khi nung (g)
2.2.2.Định tính các hợp chất trong cao Quế và cao Xạ Can
2.2.2.1.Cao Quế
Dựa vào sắc ký lớp mỏng
Mục đích: Để xác định được các thành phần hóa thực vật trong nguyên liệu Quế cũng phải hiện diện trong cao Quế và sự hiện diện của chất chuẩn aldehyd cinnamic trong cao Quế phải được kiểm tra bằng SKLM.
Dung dịch thử:
Cân khoảng 20g nguyên liệu, cho vào becher 250ml, chiết siêu âm với cồn 96% cho tới khi dịch chiết hết màu, tiếp tục chiết siêu âm bã nguyên liệu lần lượt với cồn 72% và cồn 48% đến khi kiệt. Tập trung toàn bộ dịch chiết được lọc và cô giảm áp thu hồi dung môi đến cắn. Cắn được hòa với 50ml nước cất, cho vào bể chiết siêu âm trong vòng 15 phút, lọc. Dịch nước được lắc với diethyl ether, đến khi dịch diethyl ether hết màu. Tập trung dịch diethyl ether cô còn 2ml làm dung dịch chấm sắc ký.
Cân khoảng 1g cao Quế hòa với 50ml nước cất, cho vào bể chiết siêu âm trong vòng 15 phút, lọc. Dịch nước được lắc với diethyl ether, đến khi dịch diethyl ether hết màu.Tập trung dịch diethyl ether cô còn 2ml làm dung dịch chấm sắc ký.
Bản mỏng Silica gel GF254
Dung môi khai triển: cyclohexan - ethyl acetat (9:1) n-hexan - aceton (8:2)
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10μl dd nguyên liệu và 10μl dd cao.
Cách phát hiện:
Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm. Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm.
Phun thuốc thử vanilin 5% trong ethanol. Sấy bản mỏng ở 1050C tới khi thấy vết.
Kiểm nghiệm sự hiện diện của chuẩn aldehyd cinnamic có trong
cao Quế
Bản mỏng Silica gel GF254
Dung môi khai triển: cyclohexan - ethyl acetat (9:1) ether dầu- aceton (8:2)
Dung dịch thử: Cân khoảng 1g cao Quế chiết siêu âm với diethyl ether (3 lần x 20ml), lọc. Cô dịch lọc, còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký.
Dung dịch chuẩn: Dung dịch aldehyd cinamic 1mg/1 ml diethyl ether. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10μl dd chuẩn và 10μl dd cao.
Cách phát hiện: Phun dung dịch 2,4 - dinitrophenyl hydrazin. Quan sát dưới ánh sáng thường.
2.2.2.2.Cao Xạ Can
Dựa vào phản ứng hóa học
Lấy 1 g cao Xạ Can, thêm 40ml ethanol, đun hồi lưu cách thuỷ trong 30 phút. Lọc, cô dịch lọc còn khoảng 10ml.
Phản ứng với dung dịch natrihydroxyd
Phản ứng 1: Nhỏ dịch chiết lên giấy lọc thành 2 vết riêng biệt, nhỏ tiếp lên một dịch chiết 1 giọt dung dịch natri hydroxyd 10%, để khô soi dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm. Vết dịch chiết không có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng cam nhạt, vết dịch chiết có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng sáng.
Phản ứng 2: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2ml chloroform và 2ml dung dịch natri hydroxyd 10%, lắc mạnh. Đun trên cách thuỷ 2 phút, lắc đều lớp nước kiềm có màu đỏ.
Dựa vào sắc ký lớp mỏng
Kiểm nghiệm sự hiện diện của nguyên liệu Xạ Can có trong cao
Xạ Can
Bản mỏng Silica gel GF254
Dung môi khai triển: chlorofrom - methanol (9:1) ether dầu - aceton (9:1) Dung dịch thử:
Lấy 5g bột nguyên liệu cho vào becher loại 100ml, chiết siêu âm 3 lần mỗi lần với 30ml methanol, rồi lọc. Cô dịch lọc còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký.
Lấy 1g cao Xạ Can cho vào becher loại 100ml, chiết siêu âm 3 lần mỗi lần với 30ml methanol, rồi lọc. Cô dịch lọc còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10μl mỗi dung dịch trên.
Cách phát hiện:
Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm. Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm.
Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.
Phun thuốc thử sắt (III) clorid. Quan sát dưới ánh sáng thường
Kiểm nghiệm sự hiện diện của chuẩn 31-norcycloartanyl
tridecanoat có trong cao Xạ Can.
Bản mỏng Silica gel GF254
Dung môi khai triển: ether dầu – aceton (8:2) Dung dịch thử:
Lấy 1g cao cho vào becher loại 250ml, hòa nước. Sau đó, chiết lỏng lỏng CHCl3 (3 lần x 20ml). Cô dịch lọc còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10μl mỗi dung dịch trên.
Cách phát hiện:
.Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết.
Quan sát dưới ánh sáng thường
Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm.
2.2.3.Định lượng các hợp chất trong cao Quế và cao Xạ Can
Định lượng hợp chất aldehyd cinamic bằng phương pháp quang phổ tử ngoại dựa trên chất chuẩn aldehyd cinamic.
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 5mg andehyd cinamic hòa tan trong methanol, định mức 10ml, được dung dịch A có nồng độ 0,5mg/ml. Sau đó, hút 30μl dung dịch A, định mức 5ml bằng methanol ta được dung dịch chuẩn có nồng độ 3μg/ml.
Dung dịch thử: Pha dung dịch mẫu theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 2: Định lượng hàm lượng aldehyd cinamic trong cao Quế
cao Quế
Dung dịch 1
Dung dịch 2
Hàm lượng aldehyd cinamic Xác định mật độ quang OD
Dịch chiết MeOH
Chiết siêu âm với MeOH (6 lần x10ml)
Định mức 100ml bằng MeOH
Hút 0,8ml
Lượng aldehyd cinamic có trong cao Quế được tính theo công thức sau
Trong đó:
At: Độ hấp thu mẫu thử. Ac: Độ hấp thu mẫu chuẩn Cc: Nồng độ chất chuẩn (µg/ml)
d : Độ tinh khiết của chất chuẩn (98%)
m : Khối lượng chế phẩm cần định lượng đã trừ ẩm (g). 2.2.3.2.Cao Xạ Can
Định lượng thành phần hoá thực vật trong cao Xạ Can bằng phương pháp đo phổ tử ngoại dựa trên chất chuẩn 31- norcycloartanyl tridecanoat
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1,5 mg chất chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat hòa tan trong CHCl3, định mức 10ml, được dung dịch A có nồng độ 150μg/ml. Sau đó, hút 100μl dung dịch A, định mức 10 ml bằng CHCl3 ta được dung dịch chuẩn có nồng độ 1,5μg/ml.
Dung dịch thử: Pha dung dịch mẫu cao theo sơ đồ sau
m d C A A X c c t 4 10 1250× − × × × =
Sơ đồ 3: Định lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat trong cao Xạ can cao Xạ Can Cắn MeOH Dịch CHCl3 Dung dịch 1 Cắn CHCl3 Dịch chiết MeOH
Chiết Soxhlet bằng MeOH trong vòng 12 giờ.
Cô cách thủy
Hòa nước, lắc 8 lần với CHCl3
Dung dịch 2 Cô cách thủy Định mức 25ml bằng CHCl3 Hút 40μl Định mức 10ml bằng CHCl3 Xác định mật độ quang OD Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat
Lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat có trong cao Xạ Can được tính theo công thức sau:
Trong đó:
At: Độ hấp thu mẫu thử Ac: Độ hấp thu mẫu chuẩn Cc: Nồng độ chất chuẩn (μg/ml)
d : Độ tinh khiết của chất chuẩn (90%)
m : Khối lượng chế phẩm cần định lượng đã trừ ẩm(g).
4 6250 10 t c c A X C d A m − × = × × ×
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1.1.Khảo sát độ tinh khiết của nguyên liệu 1.1.1.Độ ẩm Quế Xạ Can Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
Khối lượng nguyên
liệu(g) 10,0027 10,0020 10,0044 10,0067 10,0197 10,0137
Thể tích nước sau 2h
(ml) 1,35 1,3 1,3 1,35 1,6 1,55
Thể tích nước sau khi
cho dược liệu(ml) 2,4 2,3 2,4 2,35 2,7 2,6
Độ ẩm(%) 10,5 10,0 11,0 9,99 10,9 10,49
Trung bình 10,50 10,46
Bảng 4: Độ ẩm của nguyên liệu
• Nhận xét:
Từ kết quả trên cho thấy nguyên liệu có các giá trị về độ ẩm nằm trong giới hạn an toàn cho phép đúng theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV là độ ẩm của nguyên liệu Quế < 14% và của Xạ Can < 12%.
1.1.2.Độ tro toàn phần
Quế Xạ can
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
Khối lượng bì (g) 34,7599 38,3694 38,0464 32,1983 32,4455 35,3875
Khối lượng nguyên
liệu (g) 1,0059 1,0084 1,0093 1,0021 1,0102 1,0078
Khối lượng bì và nguyên liệu sau khi nung (g)
34,7995 38,4122 38,0882 32,2535 32,4995 35,4392
Độ tro(%) 3,9368 4,2443 4,1415 5,5084 5,3455 5,1300
Trung bình 4,1075 5,3280
nằm trong giới hạn an toàn cho phép đúng theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV là độ tro toàn phần của nguyên liệu Quế < 5% và của Xạ Can < 8,5%.
1.1.3.Độ tro không tan trong acid
Quế Xạ Can
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
Khối lượng bì (g) 34,7599 38,3694 38,0464 32,1983 32,4455 35,3872
Khối lượng nguyên
liệu (g) 1,0059 1,0084 1,0093 1,0021 1,0102 1,0078
Khối lượng bì và nguyên liệu sau khi nung (g)
34,7995 38,4122 38,0882 32,2535 32,4995 35,4392
Khối lượng còn lại
(g) 0,0002 0,0005 0,0002 0,0075 0,0065 0,0050
Độ tro (%) 0,0200 0,0500 0,0200 0,7500 0,6500 0,5000
Trung bình 0,03 0,63
Bảng 6: Độ tro không tan trong acid của nguyên liệu
• Nhận xét:
Từ kết quả trên cho thấy nguyên liệu có các giá trị về độ tro không tan trong acid nằm trong giới hạn an toàn cho phép đúng theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV là độ tro không tan trong acid của nguyên liệu Quế < 2% và của Xạ Can < 2%.
1.2.Định tính các hợp chất hóa nguyên liệu Quế và Xạ Can
1.2.1.Quế
Phản ứng hóa học
Lấy 4 giọt tinh dầu trộn với 4 giọt acid nitric, ở nhiệt độ dưới 50C, xuất hiện tinh thể trắng hoặc vàng.
nguyên liệu Quế
Cyclohexan - Ethyl acetat (9:1)
n-Hexan - Clorofrom (4:3)
1. Chuẩn 2. Nguyên liệu
Phun thuốc thử 2,4 dinitropheny hydrazin. Quan sát dưới ánh sáng thường
Hình 5: SKLM kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn aldehyd cinamic trong nguyên liệu Quế
• Nhận xét:
Màu sắc và giá trị Rf của vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ nguyên liệu Quế tương ứng với màu sắc và giá trị Rf của vết chuẩn
1.2.2.Xạ Can
Phản ứng hóa học
Phản ứng 1 Phản ứng 2
1.Nguyên liệu không có NaOH
2. Nguyên liệucó NaOH
1. Dd nguyên liệu 2. Sau khi phản ứng xảy ra
Hình 6: Phản ứng hóa học của nguyên liệu Xạ Can
• Nhận xét:
Phản ứng 1: Vết dịch chiết không có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng cam nhạt, vết dịch chiết có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng sáng.
Phản ứng 2: Sau phản ứng, lớp nước kiềm có màu đỏ. Sắc ký lớp mỏng
Kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn 31-norcycloartanyl
tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can
1.Chuẩn 2.Nguyên liệu
Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.
Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm.
Hình 7: SKLM kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn 31- norcycloartanyl tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can
• Nhận xét:
Màu sắc và giá trị Rf của vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ nguyên liệu Xạ Can tương ứng với màu sắc và giá trị Rf vết thu được của chuẩn 31- norcycloartanyl tridecanoat. Như vậy, có sự hiện diện của chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can.
Hàm lượng tinh dầu có trong nguyên liệu Quế:
Lần 1 Lần 2 Lần 3
Khối lượng nguyên liệu (g) 20,005 20,0032 20,0027
Số ml tinh dầu thu được (ml) 0,6500 0,7500 0,6500
Trung bình 0,6833
Hàm lượng tinh dầu(%) 3,7975
Bảng 7: Hàm lượng tinh dầu có trong nguyên liệu Quế
• Nhận xét:
Hàm lượng tinh dầu chiếm 3,7975% trong nguyên liệu phù hợp yêu cầu trong Dược Điển Việt Nam IV về hàm lượng tinh dầu nguyên liệu Quế là không nhỏ hơn 1% . 1.3.2.Xạ Can Lần Khối lượng nguyên liệuđã trừ ẩm (g) At Ac Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat (%) Trung bình (%) 1 4,5091 0,4670 0,4800 0,369 0,3605 0,4870 0,4660 2 4,4999 0,4490 0,4800 0,3458 0,4430 0,4360 3 4,4858 0,4760 0,4800 0,3668 0,4680 0,4600
Bảng 8: Hàm lượng 31-norcycloartanyl tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can
• Nhận xét:
Hàm lượng 31-norcycloartanyl tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can chiếm khoảng 0,3605 %.
2.1. Khảo sát độ tinh khiết của cao Quế và cao Xạ Can
2.3.1.Độ ẩm.
cao Quế cao Xạ can
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
Khối lượng bì (g) 1,8643 4,2956 4,6195 3,9016 4,3982 4,7203
Khối lượng cao (g) 0,5129 0,5082 0,5232 0,5143 0,4561 0,49352
Khối lượng bì và cao sau
khi nung (g) 2,3585 4,7849 5,1245 4,3678 4,8089 5,16842
Độ ẩm (%) 3,6459 3,7190 3,4786 9,3525 9,9540 9,1992
Trung bình 3,6145 9,5019
Bảng 9: Độ ẩm của cao Quế và cao Xạ Can
• Nhận xét:
Độ ẩm của cao Quế là 3,6145% và độ ẩm cao Xạ Can là 9,5019%
2.3.2.Độ tro toàn phần
cao Quế cao Xạ can
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
Khối lượng bì (g) 21,0783 26,3289 24,4181 35,4652 38,7715 35,3864
Khối lượng cao (g) 0,5134 0,5025 0,5384 0,5175 0,5211 0,5183
Khối lượng bì và cao
sau khi nung (g) 21,0870 26,3382 24,4289 35,4775 38,7825 35,3977
Độ tro (%) 1,6946 1,8507 2,0059 2,3768 2,1109 2,1802
Trung bình 1,8504 2,2226
Bảng 10: Độ tro toàn phần của cao Quế và cao Xạ Can
• Nhận xét:
Sắc ký lớp mỏng
Kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu trong cao Quế Cyclohexan- Ethyl acetat
(9:1)
Cyclohexan- Ethyl acetat (9:1)
Cyclohexan- Ethyl acetat (9:1)
1. Nguyên liệu 2. Cao
Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 254nm.
Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm.
Phun thuốc thử vanilin trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. 2 1 2 2 1 1
Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 254nm.
Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm.
Hình 8:SKLM kiểm tra sự hiện diện của nguyên liệu Quế trong cao Quế
• Nhận xét:
Màu sắc và giá trị Rf của các vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ nguyên liệu Quế tương ứng với màu sắc và giá trị Rf của các vết thu được của cao Quế. Như vậy, chứng tỏ các thành phần hóa thực vật trong nguyên liệu Quế cũng hiện diện trong cao Quế.
2
Cyclohexan - Etyl acetat (9:1)
Ether dầu - Aceton (8:2)
1. Chuẩn 2. Cao
Phun thuốc thử 2,4-dintrophenyl hydrazin. Quan sát dưới ánh sáng thường.
Hình 9: SKLM kiểm tra sự hiện diện của chất chuẩn aldehyd cinamic trong
cao Quế
• Nhận xét:
Màu sắc và giá trị Rf của vết thu được trên sắc đồ dung dịch thử chiết từ cao Quế tương ứng với màu sắc và giá trị Rf vết thu được của chuẩn aldehyd cinamic. Như vậy, chứng tỏ trong cao Quế có sự hiện diện của chuẩn aldehyd cinamic.
Phản ứng 1 Phản ứng 2