2.1. Xây dựng tiêu chuẩn kiếm nghiệm nguyên liệu
2.1.1.Khảo sát độ tinh khiết của nguyên liệu
2.1.1.1.Xác định độ ẩm
Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 12.13, PL-240 [1] Xác định độ ẩm bằng phương pháp cất với dung môi
Tiến hành:
-Dụng cụ (hình vẽ)
Dụng cụ bao gồm bình cầu A, được nối với ống sinh hàn C qua bộ phận xác định lượng nước. Bộ phận này bao gồm bầu ngưng tụ B, bộ phận chia vạch E và ống dẫn hơi D. Bộ phận chia vạch được chia độ đến 0,1ml. Sau quá trình cất, nước sẽ ngưng tụ ở đây vì vậy ta có thể đọc được dễ dàng lượng nước chứa trong nguyên liệuđem thử. Nguồn nhiệt thích hợp là bếp điện có biến trở hoặc đun cách dầu.
-Cách tiến hành
Cho vào bình cầu đã được làm khô 200ml toluen, 2ml nước cất. Lắp
dụng cụ (đã được sấy khô). Cất khoảng 2 giờ. Để nguội trong 30 phút. Đọc thể tích nước cất được ở ống hứng, chính xác đến 0,05ml.
Thêm vào bình cầu một lượng nguyên liệu đã cân chính xác tới 0.01g có chứa khoảng 2-3ml nước. Thêm vài mảnh đá bọt. Đun nóng nhẹ, khi toluen đã bắt đầu sôi thì điều chỉnh nhiệt để cất với tốc độ 2 giọt/giây. Khi đã cất được phần lớn nước sang ống hứng thì nâng tốc độ lên 4 giọt/1 giây. Tiếp tục cất cho tới khi mực nước cất được trong ống hứng không tăng lên nữa.
Hình 3: Dụng cụ xác định hàm lượng nước bằng phương pháp cất với dung môi
Dùng 5-10ml toluen rửa ống sinh hàn. Cất thêm 5 phút nữa. Tách bộ phận cất ra khỏi nguồn nhiệt. Nếu còn có những giọt nước đọng lại trên thành ống sinh hàn thì dùng 5ml toluen để rửa kéo xuống. Khi lớp nước và lớp toluen đã được phân tách hoàn toàn, đọc thể tích nước trong ống hứng.
Độ ẩm (X%) của nguyên liệu được tính theo công thức sau:
2 1 100 (V V ) X p × − =
V1: Số ml nước cất được sau lần cất đầu V2: Số ml mước cất được sau lần cất thứ hai p: Số g mẫu đã cân.
2.1.1.2.Độ tro toàn phần
Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ luc 9.8 (phương pháp 2)[1]
Tiến hành
Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 1g mẫu thử rải đều vào chén nung, sau đó đốt hết hơi nước của nguyên liệu trên bếp điện rồi đem nung trong lò nung ở 550oC trong 4 giờ. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung đến khối lượng giữa hai lần cân không quá 5mg. Độ tro toàn phần được tính theo công thức:
100 a X b = × X: Độ tro toàn phần (%)
a : Khối lượng nguyên liệusau khi nung(g) b: Khối lượng nguyên liệutrước khi nung (g) 2.1.1.3.Độ tro không tan trong acid
Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 9.7 (phương pháp 1)[1]
Tiến hành
Cho 25ml dung dịch acid hydrochloric 2M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc để tập trung vào chất không tan vào một phễu thuỷ tinh xốp đã cân
bì, hoặc vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng và đem nung ở 5000C đến khối lượng không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với nguyên liệuđã làm khô trong không khí.
2.1.2.Định tính các hợp chất hoá thực vật của nguyên liệu
2.1.2.1.Quế [1,3,5,10,13,16] Dựa vào phản ứng hoá học Dựa vào phản ứng hoá học
Lấy 4 giọt tinh dầu trộn với 4 giọt acid nitric, ở nhiệt độ dưới 50C, xuất hiện tinh thể trắng hoặc vàng.
Dựa vào sắc ký lớp mỏng
Kiểm nghiệm sự hiện diện của chất chuẩn trong nguyên liệu:
Bản mỏng Silica gel GF254
Dung môi triển khai: cyclohexan - ethyl acetat (9:1) n-hexan - chloroform (4:3)
Dung dịch thử: Lấy 2,0g bột nguyên liệu lắc với 10ml diethyl ether trong 3 phút, lọc. Dùng dịch lọc làm dung dịch thử.
Dung dịch chuẩn: Dung dịch aldehyd cinamic 1mg/1ml diethyl ether. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 l mỗi dung dịch trên. Cách phát hiện: Phun dung dịch 2,4- dinitrophenyl hydrazin
2.1.2.2.Xạ Can [1,2,3,5,10,13,16,20] Dựa vào phản ứng hoá học Dựa vào phản ứng hoá học
Lấy 5g bột nguyên liệu, thêm 40ml ethanol, đun hồi lưu cách thuỷ trong 30 phút. Lọc, cô dịch lọc còn khoảng 10ml.
Phản ứng với dung dịch natri hydroxyd
Phản ứng 1: Nhỏ dịch chiết lên giấy lọc thành 2 vết riêng biệt, nhỏ tiếp lên một dịch chiết 1 giọt dung dịch natri hydroxyd 10%, để khô soi dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm. Vết dịch chiết không có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng cam nhạt, vết dịch chiết có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng sáng.
Phản ứng 2: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2ml chloroform và 2ml dung dịch natri hydroxyd 10%, lắc mạnh. Đun trên cách thuỷ 2 phút, lắc đều, lớp nước kiềm có màu đỏ.
Dựa vào sắc ký lớp mỏng Bản mỏng Silica gel GF254
Dung môi khai triển: ether dầu – aceton (8:2) Dung dịch thử:
Lấy 10g bột nguyên liệu cho vào becher loại 250ml, chiết siêu âm 3 lần mỗi lần với 50ml methanol, lọc lấy dịch nước đem cô cắn rồi hòa với 20ml nước cất. Sau đó, chiết lỏng lỏng với CHCl3 (3 lần x 20ml). Cô dịch lọc còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký.
Dung dịch chuẩn: Dung dịch 31- norcycloartanyl tridecanoat 2mg/1ml trong CHCl3.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10μl mỗi dung dịch trên.
Cách phát hiện:
Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết.
Quan sát dưới ánh sáng thường
Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm.
2.1.3.Định lượng các hợp chất hóa thực vật trong nguyên liệu
2.1.3.1.Quế[1]
Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất lôi cuốn theo hơi nước trong nguyên liệu Quế.
Dụng cụ thí nghiệm: Cất tinh dầu
Cân chính xác 20g nguyên liệu đã được xay nhỏ vào bình cầu dung tích 500 ml của bộ dung cụ định lượng tinh dầu trong dược điển. Thêm 200ml dung dịch acid hydrocloric 0,1N. Tiến hành
cất trong 3 giờ (tốc độ cất 2,5-3,5ml/phút). Ngừng cất Sau 15 phút đọc thể tích tinh dầu ở phần chia vạch.
Tính hàm lượng tinh dầu theo công thức: 100
a X
b
= ×
X: hàm lượng phần trăm tinh dầu (ml/g) a: thể tích tinh dầu đọc được sau khi cất (ml) b: khối lượng nguyên liệu đã trừ độ ẩm (g)
2.1.3.2.Xạ Can
Định lượng thành phần hóa thực vật trong Xạ Can bằng phương pháp đo phổ tử ngoại khả kiến dựa trên chất chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat.
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1,5mg chất chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat hòa tan trong CHCl3, định mức 10ml, được dung dịch A có nồng độ 150μg/ml. Sau đó, hút 100μl dung dịch A, định mức 10ml bằng CHCl3 ta được dung dịch chuẩn có nồng độ 1,5μg/ml.
Dung dịch thử: Pha dung dịch mẫu cao theo sơ đồ sau
Sơ đồ 1: Định lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat trong nguyên liệu Xạ Can
Nguyên liệu Xạ Can
Cắn MeOH
Dịch CHCl3
Dung dịch 1 Cắn CHCl3
Dịch chiết MeOH
Chiết Soxhlet bằng MeOH trong vòng 12 giờ.
Cô cách thủy
Hòa nước, lắc 8 lần với CHCl3
Dung dịch 2 Cô cách thủy Định mức 25ml bằng CHCl3 Hút 100μl Định mức 10ml bằng CHCl3 Xác định mật độ quang OD Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat Hút 1ml Định mức 5ml bằng CHCl3 Dung dịch 3
Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat có trong cao Xạ Can được tính theo công thức sau:
Trong đó:
At: Độ hấp thu mẫu thử. Ac : Độ hấp thu mẫu chuẩn Cc : Nồng độ chất chuẩn (μg/ml)
d : Độ tinh khiết của chất chuẩn (90%)
m : Khối lượng nguyên liệu cần định lượng đã trừ ẩm (g).
2.2. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Quế và cao Xạ Can
2.2.1.Khảo sát độ tinh khiết của cao Quế và cao Xạ Can 2.2.1.1.Xác định độ ẩm
Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 12.16 [1] Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy
Nguyên tắc
Cao được sấy ở 105oC, nước trong mẫu sẽ bốc hơi làm giảm khối lượng mẫu, cân khối lượng mẫu sau khi sấy sẽ tính được độ ẩm của mẫu cao.
Tiến hành
Cho vào chén cân dùng để xác định độ ẩm, đã được cân bì trước. Chén cân cần có kích thước thích hợp để lớp cao cho vào không dày quá 5mm. Cho chén chứa cao vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100 -1050C trong 4 giờ. Cho chén vào bình hút ẩm đến khi nguội. Làm lại nhiều lần đến khi trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0,5mg.
4 12500 10 t c c A X C d A m − × = × × ×
Độ ẩm (X %) của cao được tính theo công thức sau: 100 p a X p − = ×
p: Số gam mẫu thử trước khi sấy (g) a: Số gam mẫu thử sau khi sấy (g) 2.2.1.2.Độ tro toàn phần
Theo tiêu chuẩn DĐVN IV, phụ lục 9.8[1]
Tiến hành
Lấy một chén sứ nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lấy 0,5g cao rải đều vào chén nung, sau đó đốt hết hơi nước của cao trên bếp điện rồi đem nung trong lò nung ở 550oC trong 4 giờ. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung đến khối lượng giữa hai lần cân không quá 5mg. Độ tro toàn phần được tính theo công thức:
100 a X b = × X: Độ tro toàn phần (%)
a: Khối lượng cao sau khi nung(g) b: Khối lượng cao trước khi nung (g)
2.2.2.Định tính các hợp chất trong cao Quế và cao Xạ Can
2.2.2.1.Cao Quế
Dựa vào sắc ký lớp mỏng
Mục đích: Để xác định được các thành phần hóa thực vật trong nguyên liệu Quế cũng phải hiện diện trong cao Quế và sự hiện diện của chất chuẩn aldehyd cinnamic trong cao Quế phải được kiểm tra bằng SKLM.
Dung dịch thử:
Cân khoảng 20g nguyên liệu, cho vào becher 250ml, chiết siêu âm với cồn 96% cho tới khi dịch chiết hết màu, tiếp tục chiết siêu âm bã nguyên liệu lần lượt với cồn 72% và cồn 48% đến khi kiệt. Tập trung toàn bộ dịch chiết được lọc và cô giảm áp thu hồi dung môi đến cắn. Cắn được hòa với 50ml nước cất, cho vào bể chiết siêu âm trong vòng 15 phút, lọc. Dịch nước được lắc với diethyl ether, đến khi dịch diethyl ether hết màu. Tập trung dịch diethyl ether cô còn 2ml làm dung dịch chấm sắc ký.
Cân khoảng 1g cao Quế hòa với 50ml nước cất, cho vào bể chiết siêu âm trong vòng 15 phút, lọc. Dịch nước được lắc với diethyl ether, đến khi dịch diethyl ether hết màu.Tập trung dịch diethyl ether cô còn 2ml làm dung dịch chấm sắc ký.
Bản mỏng Silica gel GF254
Dung môi khai triển: cyclohexan - ethyl acetat (9:1) n-hexan - aceton (8:2)
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10μl dd nguyên liệu và 10μl dd cao.
Cách phát hiện:
Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm. Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm.
Phun thuốc thử vanilin 5% trong ethanol. Sấy bản mỏng ở 1050C tới khi thấy vết.
Kiểm nghiệm sự hiện diện của chuẩn aldehyd cinnamic có trong
cao Quế
Bản mỏng Silica gel GF254
Dung môi khai triển: cyclohexan - ethyl acetat (9:1) ether dầu- aceton (8:2)
Dung dịch thử: Cân khoảng 1g cao Quế chiết siêu âm với diethyl ether (3 lần x 20ml), lọc. Cô dịch lọc, còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký.
Dung dịch chuẩn: Dung dịch aldehyd cinamic 1mg/1 ml diethyl ether. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10μl dd chuẩn và 10μl dd cao.
Cách phát hiện: Phun dung dịch 2,4 - dinitrophenyl hydrazin. Quan sát dưới ánh sáng thường.
2.2.2.2.Cao Xạ Can
Dựa vào phản ứng hóa học
Lấy 1 g cao Xạ Can, thêm 40ml ethanol, đun hồi lưu cách thuỷ trong 30 phút. Lọc, cô dịch lọc còn khoảng 10ml.
Phản ứng với dung dịch natrihydroxyd
Phản ứng 1: Nhỏ dịch chiết lên giấy lọc thành 2 vết riêng biệt, nhỏ tiếp lên một dịch chiết 1 giọt dung dịch natri hydroxyd 10%, để khô soi dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365nm. Vết dịch chiết không có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng cam nhạt, vết dịch chiết có natri hydroxyd cho huỳnh quang màu vàng sáng.
Phản ứng 2: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2ml chloroform và 2ml dung dịch natri hydroxyd 10%, lắc mạnh. Đun trên cách thuỷ 2 phút, lắc đều lớp nước kiềm có màu đỏ.
Dựa vào sắc ký lớp mỏng
Kiểm nghiệm sự hiện diện của nguyên liệu Xạ Can có trong cao
Xạ Can
Bản mỏng Silica gel GF254
Dung môi khai triển: chlorofrom - methanol (9:1) ether dầu - aceton (9:1) Dung dịch thử:
Lấy 5g bột nguyên liệu cho vào becher loại 100ml, chiết siêu âm 3 lần mỗi lần với 30ml methanol, rồi lọc. Cô dịch lọc còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký.
Lấy 1g cao Xạ Can cho vào becher loại 100ml, chiết siêu âm 3 lần mỗi lần với 30ml methanol, rồi lọc. Cô dịch lọc còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10μl mỗi dung dịch trên.
Cách phát hiện:
Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm. Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365nm.
Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.
Phun thuốc thử sắt (III) clorid. Quan sát dưới ánh sáng thường
Kiểm nghiệm sự hiện diện của chuẩn 31-norcycloartanyl
tridecanoat có trong cao Xạ Can.
Bản mỏng Silica gel GF254
Dung môi khai triển: ether dầu – aceton (8:2) Dung dịch thử:
Lấy 1g cao cho vào becher loại 250ml, hòa nước. Sau đó, chiết lỏng lỏng CHCl3 (3 lần x 20ml). Cô dịch lọc còn khoảng 2ml dùng để chấm sắc ký.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10μl mỗi dung dịch trên.
Cách phát hiện:
.Phun thuốc thử acid sunfuric 10% trong ethanol, sấy ở 1050C đến khi xuất hiện vết.
Quan sát dưới ánh sáng thường
Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm.
2.2.3.Định lượng các hợp chất trong cao Quế và cao Xạ Can
Định lượng hợp chất aldehyd cinamic bằng phương pháp quang phổ tử ngoại dựa trên chất chuẩn aldehyd cinamic.
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 5mg andehyd cinamic hòa tan trong methanol, định mức 10ml, được dung dịch A có nồng độ 0,5mg/ml. Sau đó, hút 30μl dung dịch A, định mức 5ml bằng methanol ta được dung dịch chuẩn có nồng độ 3μg/ml.
Dung dịch thử: Pha dung dịch mẫu theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 2: Định lượng hàm lượng aldehyd cinamic trong cao Quế
cao Quế
Dung dịch 1
Dung dịch 2
Hàm lượng aldehyd cinamic Xác định mật độ quang OD
Dịch chiết MeOH
Chiết siêu âm với MeOH (6 lần x10ml)
Định mức 100ml bằng MeOH
Hút 0,8ml
Lượng aldehyd cinamic có trong cao Quế được tính theo công thức sau
Trong đó:
At: Độ hấp thu mẫu thử. Ac: Độ hấp thu mẫu chuẩn Cc: Nồng độ chất chuẩn (µg/ml)
d : Độ tinh khiết của chất chuẩn (98%)
m : Khối lượng chế phẩm cần định lượng đã trừ ẩm (g). 2.2.3.2.Cao Xạ Can
Định lượng thành phần hoá thực vật trong cao Xạ Can bằng phương pháp đo phổ tử ngoại dựa trên chất chuẩn 31- norcycloartanyl tridecanoat
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1,5 mg chất chuẩn 31-norcycloartanyl tridecanoat hòa tan trong CHCl3, định mức 10ml, được dung dịch A có nồng độ 150μg/ml. Sau đó, hút 100μl dung dịch A, định mức 10 ml bằng CHCl3 ta được dung dịch chuẩn có nồng độ 1,5μg/ml.
Dung dịch thử: Pha dung dịch mẫu cao theo sơ đồ sau
m d C A A X c c t 4 10 1250× − × × × =
Sơ đồ 3: Định lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat trong cao Xạ can cao Xạ Can Cắn MeOH Dịch CHCl3 Dung dịch 1 Cắn CHCl3 Dịch chiết MeOH
Chiết Soxhlet bằng MeOH trong vòng 12 giờ.
Cô cách thủy
Hòa nước, lắc 8 lần với CHCl3
Dung dịch 2 Cô cách thủy Định mức 25ml bằng CHCl3 Hút 40μl Định mức 10ml bằng CHCl3 Xác định mật độ quang OD Hàm lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat
Lượng 31- norcycloartanyl tridecanoat có trong cao Xạ Can được tính theo công thức sau:
Trong đó:
At: Độ hấp thu mẫu thử Ac: Độ hấp thu mẫu chuẩn