- Cá giống có trọng lượng trung bình 19,7g được đánh dấu PIT để phân biệt theo từng cá thể và gia đình. Trước khi đánh dấu, ghi nhận khối lượng của từng cá thể. Dấu PIT được tiêm vào cơ dưới gốc vây lưng hướng về phía đầu (Hình 2.6).
- Để tránh nhiễm trùng cho cá, dùng cồn 900 để sát trùng tay, kim tiêm, dấu PIT và các thiết bị sử dụng khi đánh dấu. Cá đã đánh dấu được thả vào bể composite 1,5 m3 có pha thuốc tím (nồng độ 10 mg/m3) để sát trùng vết thương. Sau 15 - 20 phút, cá được chuyển sang bể composite 30 m3 để theo dõi tình trạng sức khỏe và khả năng lưu tồn dấu. Việc đánh dấu diễn ra từ ngày 16/12 đến ngày 26/12/2011.
Hình 2.6. Đánh dấu PIT cho cá Tra giống.
- Cá giống sau khi đánh dấu PIT được chia thành hai nhóm:
+ Nhóm cá thí nghiệm về khả năng kháng bệnh: 30 con/gia đình được chia đều ngẫu nhiên vào hai bể composite 30 m3 (mỗi bể trung bình 15 con/gia đình) (Hình 2.7).Cá được thuần dưỡng trong bể composite và cho ăn thức ăn viên công nghiệp 28% đạm với khẩu phần 1% tổng khối lượng cá.
Hình 2.7. Bể composite 30 m3để thuần dưỡng cá thí nghiệm.
+ Nhóm cá nuôi thương phẩm để đánh giá tính trạng tăng trưởng: Mỗi gia đình 60 con được thả nuôi trong cùng một ao để loại bỏ khả năng ảnh hưởng không đồng bộ của môi trường (Hình 2.8). Diện tích ao 2000 m2, độ sâu 1,5m. Cho cá ăn đầy đủ bằng thức ăn viên công nghiệp 22-28% đạm ở nhiều vị trí khác nhau trong ao nuôi để giảm thiểu khả năng ảnh hưởng của thức ăn lên tính trạng khảo sát.
2.3.3. Gây bệnh gan thận mủ thực nghiệm cho cá giống các gia đình sản xuất
- Phương pháp gây bệnh gan thận mủthực nghiệm:
+ Để gây bệnh gan thận mủthực nghiệm, phương pháp cho cá cohabitant sống chung với cá thí nghiệm kết hợp với việc bổ sung vi khuẩn vào trong môi trường được áp dụng. Mỗi gia đình chọn ngẫu nhiên 10 con, không đánh dấu PIT để tạo cá cohabitant. Tạo cá bệnh cohabitant bằng phương pháp tiêm vào xoang bụng cá, liều tiêm cho cá cohabitant là 1x105 vi khuẩn/cá (Hình 2.9). Trước khi tiêm vi khuẩn, cá được gây mê bằng ethylene glycol phenyl ether pha với nồng độ 10 ml/m3 nước. Sau đó cho cá vào thùng nhựa có sục khí, khi cá cohabitant tỉnh hoàn toàn sẽ được thả vào sống chung với cá thí nghiệm. Tỷ lệ cá cohabitant trên cá thí nghiệm là 30%.
Hình 2.9.Tiêm vi khuẩn tạo cá cohabitant.
+ Theo Crumlish, vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá Tra giống ở nhiệt độ 23 - 280C [19]. Nhưng nhiệt độ 260
C là mức thích hợp nhất để vi khuẩn E. ictaluri hoạt động [44], [48], [49]. Do đó, để cá có thể dễ dàng nhiễm bệnh và chết cao do vi khuẩn E. ictaluri thì phải tạo điều kiện môi trường tương đối bất lợi cho sức khỏe cá thí nghiệm và tạo môi trường nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn E. ictaluri hoạt động:
Hạ mực nước xuống 50% để gây stress cá 1 ngày trước khi thí nghiệm, mật độ 10 kg/m3
.
Điều chỉnh nhiệt độ nước thấp và ổn định ở 260
C bằng máy điều hòa nhiệt độ.
Vẫn cho ăn hằng ngày với khẩu phần 1 - 1,5% tổng trọng lượng cá trong bể, không thay nước và sục khí trong suốt quá trình thí nghiệm.
Hình 2.10. Phòng thí nghiệm cảm nhiễm cho cá.
- Cách tiến hành gây bệnh thực nghiệm:
+ Cá giống sau khi đánh dấu được thuần dưỡng trong hai bể composite 30 m3
trong 5 ngày tại Trung tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nước Ngọt Nam Bộ. Trong thời gian này, thường xuyên kiểm tra để bù số cá chết từ các gia đình tương ứng, nhằm đảm bảo số lượng cá đại diện của từng gia đình [5]. Sau đó, cá được chuyển đến Cơ sở Thực nghiệm Gò Vấp - 139/1152 Lê Đức Thọ, Phường 13, Quận Gò Vấp, Tp. Hồ chí Minh - ngày 31/12/2011 và tiếp tục được thuần dưỡng trong hai bể composite 30 m3 trong 2 ngày để hoàn toàn thích nghi với môi trường mới (Hình 2.10).
+ Ngày 3/1/2012: Khoảng 30 con/bể được chọn ngẫu nhiên để thu mẫu và cấy kiểm tra nhằm xác định là cá đã hay chưa nhiễm mầm bệnh E. ictaluri sử dụng trong thí nghiệm.
+ Ngày 4/1/2012: Cá cohabitant được tiêm mầm bệnh và thả vào sống chung với cá thí nghiệm.
+ Ngày 7/1/2012, bắt đầu bổ sung vi khuẩn với liều lượng 7x105 vi khuẩn/ml. Duy trì việc bổ sung vi khuẩn vào bể hàng ngày, số lần bổ sung vi khuẩn là 3 ngày. Mục đích của việc thêm dung dịch vi khuẩn để tăng cường và duy trì sự cung cấp mầm bệnh cho môi trường trong thời gian dài hơn nhằm tăng khả năng mắc bệnh và gây chết cho cá thí nghiệm.
Bảng 2.1. Thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm gan thận mủ trên đàn cá chọn giống.
Các chỉ tiêu kỹ thuật Số lượng
Mật độ thí nghiệm (kg/m3) 10
Số bể thí nghiệm (lần lặp lại) 2
Tỷ lệ ghép cá cohabitant/cá thí nghiệm (%) 30 Liều tiêm vi khuẩn cho cá cohabitant (Vi khuẩn/cá) 1x105 Liều bổ sung vi khuẩn còn lại (Vi khuẩn/ml) 7x105
+ Ngày 14/1/2012: Kiểm tra tác nhân gây bệnh/chết cá trong ngày có nhiều cá chết nhất. Khoảng 50 con cá chết/bể sẽ được thu mẫu (Hình 2.11) để phân lập và định danh tác nhân gây bệnh có phải là mầm bệnh sử dụng hay không.
+ Ngày 21/1/2012: Kết thúc thí nghiệm. Cá còn sống được đếm số lượng, cân và xác định hiện trạng nhiễm bệnh từng cá thể. Cá còn sống bị tiêu hủy và bể thí nghiệm cũng được sát trùng bằng nước chlor nồng độ cao trước khi xả ra ngoài. Cá chết trong quá trình thí nghiệm và cá còn sống sau thí nghiệm được nấu chín trước khi cho vào hố tẩy trùng.
- Các công việc thực hiện hàng ngày trong quá trình theo dõi thí nghiệm: + Theo dõi một số chỉ tiêu chất lượng nước hàng ngày: nhiệt độ, oxy hòa tan,
pH, NH3 bắt đầu từ lúc chuyển cá về cho đến khi kết thúc thí nghiệm.
+ Cho cá ăn khẩu phần 1% tổng trọng lượng cá trong bể trước khi kiểm tra và vớt cá chết. Tính toán để điều chỉnh lượng thức ăn cho ngày tiếp theo dựa trên số cá chết đã vớt ra sao cho vẫn đảm bảo 1% tổng trọng lượng cá trong bể.
+ Vớt cá chết ra ngoài 2 lần/ngày vào lúc 9 giờ sáng và 14 giờ chiều:
Cá cohabitant: kiểm tra có dấu PIT hay không để tránh lầm lẫn với cá thí nghiệm, sau đó đem tiêu hủy.
Cá thí nghiệm: Ghi nhận lại các số liệu của từng cá thể như ngày chết, giờ chết, dấu PIT, khối lượng và các dấu hiệu ngoại quan và trong nội tạng; sau đó đem tiêu hủy.
Hình 2.11.Cấy kiểm tra tác nhân vi sinh gây chết cá.
2.3.4. Ước tính các thông số di truyền của tính trạng tăng trưởng
2.3.4.1. Thu thập số liệu cho tính trạng tăng trưởng
- Các số liệu thu thập từ lúc sinh sản đến lúc đánh dấu bao gồm: dấu PIT từng cá bố mẹ tham gia sinh sản, đợt sinh sản, ngày sinh sản, ngày đánh dấu và trọng lượng lúc đánh dấu.
- Các số liệu thu thập khi cá đạt kích cỡ thương phẩm trung bình 1,0 kg bao gồm: dấu PIT từng cá thể, ngày thu mẫu thu thập số liệu, trọng lượng cơ thể cho tất cả cá thể còn sống. Cá được ngưng cho ăn 2 ngày trước khi thu mẫu và được cân theo từng cá thể (Hình 2.12), không cần phân biệt đực - cái. Trước khi cân, cá được gây mê trong vòng 10 phút bằng ethylene glycol phenyl ether với nồng độ 30 ml/m3. Sau đó cho cá vào bể composite 1,5 m3 có sục khí, khi cá tỉnh hoàn toàn (khoảng 30 phút) sẽ được chuyển xuống ao. Thời gian thu hoạch từ 10/9/2012 đến 30/9/2012.
Hình 2.12. Cân cá thương phẩm.
- Để ước tính hiệu quả chọn lọc và hệ số di truyền thực tế (H2) cho quần đàn bố mẹ thông qua đàn con tương ứng, quần đàn G3 - 2001 (làm quần đàn cơ bản) bao gồm nhóm chọn lọc và nhóm đối chứng. Ngoài nhóm đối chứng cùng thế hệ và quần đàn, quần đàn tự nhiên cũng được xem là quần đàn đối chứng (chưa qua chọn lọc). Phương pháp so sánh này được áp dụng trên một số đối tượng thủy sản [36].
2.3.4.2. Hệ số di truyền ước tính (h2), hệ số di truyền thực tế (H2) và hiệu quả chọn lọc thực tế (R) của tính trạng tăng trưởng
- Xác định hệ số di truyền ước tính tính trạng tăng trưởng đàn con từ các gia đình sản xuất theo 2.3.1.1.
Phần mềm Microsoft Excel để kiểm tra số liệu, phần mềm SAS (phiên bản 9.1) để xử lý thống kê mô tả và phần mềm ASReml (phiên bản 3) được dùng để xử lý số liệu. Sử dụng phương trình tuyến tính cá thể hỗn hợp để tính toán các phương sai thành phần:
Y= Xb + Za + Wf + e (1)
Trong đó:
Y: vector của n giá trị đo trên k tính trạng. b: vector của ảnh hưởng cố định
a: vector của ảnh hưởng di truyền cộng gộp ngẫu nhiên
f: vector ảnh hưởng ngẫu nhiên của các yếu tố không di truyền lên các gia đình: ảnh hưởng của ương riêng rẽ các gia đình và ảnh hưởng của tính trạng theo mẹ.
e: vector ảnh hưởng của sai số
X: ma trận mẫu liên quan đến các ảnh hưởng cố định
Z: ma trận mẫu liên quan đến ảnh hưởng di truyền cộng gộp W: ma trận mẫu liên quan đến số lượng gia đình f.
Hệ số di truyền ước tính (h2):
h2 =
V V
P
A (2)
Trong đó Va là phương sai di truyền cộng gộp, Va= σ2
a=4* σ2
s và VP là phương sai kiểu hình tính trạng, VP=σ2
p=σ2
a+σ2
f +σ2
e. - Hệ số di truyền thực tế (H2) cho quần đàn bố mẹ:
H2=
S R
S là khác biệt của chọn giống: tức là sự khác biệt giá trị trung bình kiểu hình của nhóm chọn lọc so với nhóm đối chứng ở thế hệ bố mẹ. R: là hiệu quả chọn lọc thực tế cho quần đàn bố mẹ thông qua đàn con.
- Hiệu quả chọn lọc thực tế cho quần đàn bố mẹ thông qua đàn con tương ứng: R = WS – WC (4)
Trong đó WS là giá trị trung bình kiểu hình của nhóm chọn lọc, WClà giá trị trung bình kiểu hình của nhóm đối chứng.
2.3.5. Ước tính các thông số di truyền của tính trạng kháng bệnh gan thận mủ
2.3.5.1. Thu thập số liệu cho tính trạng kháng bệnh gan thận mủ
- Số liệu trong thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm được thu thập như nhau ở tất cả các lần lặp lại.
- Xác định thời gian kết thúc gây bệnh thực nghiệm: quá trình gây bệnh thực nghiệm kết thúc khi tỷ lệ chết đạt 50%. Đây là mức tỷ lệ chết được khuyến cáo sẽ cho kết quả đánh giá chính xác và hiệu quả nhất các thông số di truyền của tính trạng kháng bệnh [33], [56].
- Khả năng sống/chết (nhị phân): khi kết thúc quá trình gây bệnh thực nghiệm, tiến hành kiểm tra dấu của cá còn sống, từ đó xác định số cá chết của từng gia đình. Cá chết được mã hóa là 0, cá còn sống được mã hóa là 1 [31], [32].
- Khả năng sống sót của cá theo ngày: đây chính là chỉ tiêu sống/chết (nhị phân) nhưng được biểu diễn theo từng ngày. Ví dụ: nếu một cá thể chết vào ngày thứ 3 sau khi bắt đầu gây bệnh thực nghiệm, khả năng sống sót của cá thể đó theo ngày sẽ là [1 1 0]. Việc thu thập số liệu theo ngày sẽ tiếp tục cho đến khi kết thúc quá trình gây bệnh thực nghiệm [57].
- Khả năng kháng bệnh theo thời gian cá chết: đo đạc theo thời gian (giờ, ngày) từ lúc gây cảm nhiễm đến lúc chết. Nó phản ảnh mức độ kháng bệnh gan thận mủ của từng cá thể bằng cách đo đạc nguy cơ bị chết của cá trong quá trình cảm nhiễm; do đó, giá trị thu được càng cao sẽ diễn tả khả năng bị chết sẽ cao hơn. Cá còn sống sau thời gian cảm nhiễm được giả định là sẽ chết một lúc nào đó sau cảm nhiễm. Cá có thời gian này dài hơn được cho rằng có khả năng kháng bệnh gan thận mủ cao hơn [57].
- Kết thúc thí nghiệm: Toàn bộ cá còn sống sau cảm nhiễm được mổ để đánh giá mức độ dấu hiệu bệnh lý theo 4 bậc nhằm hỗ trợ cho xử lý số liệu, đặc biệt trong trường hợp tỷ lệ cá chết <50%.
2.3.4.2. Ước tính hệ số di truyền (h2) và giá trị chọn giống (EBV) của tính trạng kháng bệnh gan thận mủ
- Ước tính hệ số di truyền (h2
):
Nếu tương quan di truyền của 1 chỉ tiêu giữa các bể gây bệnh thực nghiệm (các lần lặp lại) cao thì chúng ta có thể gộp chung số liệu các lần lặp lại thành một để phân tích. Trong trường hợp này, độ chính xác của phương sai sẽ cao hơn.
Đối với tính trạng kháng bệnh, chúng ta chỉ có thể ước tính chính xác được phương sai di truyền chung của con bố và mẹ gọi là σ2
sd (s: con bố và d: con mẹ) và phương sai của yếu tố môi trường (do ương riêng rẽ các gia đình đến lúc đánh dấu) σ2
c. Hệ số di truyền của tính trạng kháng bệnh được tính toán như sau: Công thức: h2 = 4σ2 sd/ (2σ2 sd + σ2 c + σ2 e) (5) Trong đó: σ2
sd: Phương sai của cá bố mẹ σ2
c: Phương sai của môi trường σ2
e: Phương sai số dư
Các mô hình toán khác nhau được dùng để phân tích các dạng số liệu khác nhau nhằm tính toán các thông số di truyền một cách chính xác nhất.
+ Mô hình toán Threshold Binary Model (TBM)
Dùng mô hình toán Threshold Binary Model (TBM) để phân tích số liệu tính trạng nhị phân cá chết/sống sau thời gian gây bệnh thực nghiệm, giả định rằng l là một biến về khả năng xảy ra chết/sống trong quá trình gây bệnh thực nghiệm. Nếu lijk≤ 0, tương ứng Yijk = 0, nghĩa là cá k của con đực i và con cái j bị chết trong quá trình gây bệnh thực nghiệm. Nếu lijk ≥ 0, tương ứng với Yijk= 1, nghĩa là cá k của con đực i và con cái j còn sống.
Mô hình toán được sử dụng là:
Trong đó:
µ: Trung bình tổng thể
si: ảnh hưởng di truyền ngẫu nhiên của cá đực i dj: Ảnh hưởng di truyền ngẫu nhiên của cá cái j cij: Ảnh hưởng ngẫu nhiên của môi trường Φ (µ + si + dj + cij): hàm lũy tích phân bố chuẩn Phương sai số dư được cố định bằng 1.
Sử dụng phần mềm ASReml để xử lý số liệu này [28].
+ Mô hình toán Linear Repeatability Model (LRM)
Dùng mô hình toán Linear Repeatability Model (LRM) để phân tích số liệu tính trạng nhị phân lặp lại, cá chết/sống hàng ngày trong thời gian gây bệnh thực nghiệm: Yijklt = p p j k jk ijklt
nf p e c d s t Z + + + + ∑ = ) ( 0 β (7)
Trong đó Yijklt là tính trạng của cá k của gia đình j, với bố là i và mẹ là j tại thời điểm kiểm tra t, βp là hệ số hồi qui của bậc trực giao đa thứcZp(t), Zp(t) là p bậc trực giao đa thức của thời gian t, nf là thứ bậc hiệu chỉnh cho đa thức Legendre, si là ảnh hưởng di truyền ngẫu nhiên của cá đực i, dj là ảnh hưởng di truyền ngẫu nhiên của cá cái j, cij là ảnh hưởng ngẫu nhiên của môi trường ương riêng lẻ các gia đình, và eijklt là ảnh hưởng ngẫu nhiên của số dư.
Sử dụng phần mềm ASReml để xử lý số liệu này [28].
+ Mô hình toán Weibull Frailty Model (WFM)
Dùng mô hình toán WFM để phân tích số liệu khả năng kháng bệnh theo thời gian cá chết như sau:
λijk(t) = λ0(t)exp(si + dj) (8)
Trong đó:
λijk: hàm số về mối nguy của ngày theo dõi t của cá k thuộc con đực i và con cái j.
λ0 (t) = λp (λt)p-1: Ranh giới chuẩn Weibull của hàm số về mối nguy trong ngày theo dõi t với các chỉ số λ>0 và p>0.
si: ảnh hưởng di truyền ngẫu nhiên của cá đực i dj: Ảnh hưởng di truyền ngẫu nhiên của cá cái j