4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
2.3.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu nước phân lập
Về nguyên tắc cần thu mẫu sao cho mẫu thu được có tính đại diện cho khối lượng nước cần phân tích. Quá trình lấy mẫu chúng tôi sử dụng bình thu mẫu loại dùng một lần hoặc có thể dùng nhiều lần. Trường hợp dùng bình chứa sử dụng nhiều lần, chất liệu bình phải cho phép khử trùng lặp lại nhiều lần mà không tạo ra các tạp chất ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật. Tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc thu, bảo quản và vận chuyển mẫu. Mẫu nước được thu vào bình đã khử trùng, cần chừa môt khoảng không khí đủ lớn giữa mặt nước và nắp bình. Chọn ở độ sâu 20 – 30cm để thu mẫu. Trên mỗi bình chứa mẫu cần ghi chú rõ ràng, đầy đủ các thông tin cần thiết (địa điểm, thời gian, mục đích,…). Mẫu bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4oC trong thùng xốp vận chuyển về phòng thí nghiệm phân tích liền hoặc trường hợp chưa thể phân tích được chúng ta bảo quản mẫu trong tủ lạnh ở 4oC [19].
2.3.2.2. Phương pháp phân lập
Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorov [25].
Cách tiến hành:
- Lấy 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước cất, lắc đều,
ta có độ pha loãng 10-1 . Hút ra 1ml cho tiếp tục vào ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước cất, lắc đều, ta có độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng cho đến nồng độ cần thiết.
- Dùng pipet vô trùng hút dịch pha loãng ở nồng độ từ 10-2 - 10-6 khoảng 0.1ml nhỏ vào hộp lồng chứa môi trường phân lập đã vô trùng, dùng que gạt trang đều trên mặt thạch. Sau đó, bao gói cẩn thận và nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 35-39oC. Sau 3 – 7 ngày nuôi cấy, chọn những khuẩn lạc riêng lẽ, mọc mạnh, cấy sang ống thạch nghiên chứa cùng môi trường phân lập cho đến khi thần chủng.
2.3.2.3. Một số phương pháp nghiên cứu định danh VSV (a). Phương pháp nhuộm Gram.
Để quan sát khả năng bắt màu nhằm phân biệt đó là VK Gram âm hay Gram dương, đồng thời có thể nhận diện được hình dạng của các chủng VK chúng tôi tiến hành nhuộm Gram theo phương pháp sau [18]:
Bước một, làm vết bôi và cố định tiêu bản:
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính. Cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên vết bôi 1-2 giọt cồn 95o. Đốt cháy và dập tắt ngay khoảng 10 giây. Cố định vết bôi nhằm mục đích gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn.
Bước hai, nhuộm màu: nhuộm vết bôi bằng dung dịch tím kết tinh trong 30
giây đến 1 phút, rửa nước; nhuộm tiếp với dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước; tiếp theo, tẩy màu bằng cồn 96o trong 15 - 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước; cuối cùng, nhuộm với dung dịch safranin hoặc fuchsin trong 1 phút, rửa nước, để khô. Lần nhuộm này cả hai nhóm VK đều bắt giữ thuốc nhuộm, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi VK Gram âm trở nên đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin).
Kết quả: Quan sát
màu xanh đen hay tím, Gram âm b (fuchsin) [10], [17].
Để có kết quả nhanh chúng tôi c hucker cải tiến dùng KOH 3% đ được trong 30s. Dùng que tăm nh không có sự xuất hiện các s
phá vỡ, thoát ra ngoài. Đó là các VK Gram xuất hiện chứng tỏ VK thu
(b). Phương pháp nhu
Tiến hành nhuộm bào t
- Làm vết bôi vớ
bôi khô tự nhiên.
- Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên v
giữ 2 phút rồi rửa nước. - Đặt lên vết bôi mi bốc hơi. Nếu thuốc nhu
- Bỏ giấy ra và rử
- Nhuộm vết bôi b
- Rửa nước để khô t
- Quan sát tiêu bả
uan sát tiêu bản ở vật kính dầu 100x sẽ thấy VK
màu xanh đen hay tím, Gram âm bắt màu đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đ
nhanh chúng tôi cũng đã tiến hành thực hiệ KOH 3% để phá vỡ thành tế bào của các ch c trong 30s. Dùng que tăm nhỏ nhúng vào dịch huyền phù này và nh
n các sợi nhày nhớt, là kết quả của các sợi ADN trong nhân b , thoát ra ngoài. Đó là các VK Gram dương (+). Nếu các s
VK thuộc nhóm Gram âm (-).
Phương pháp nhuộm bào tử
m bào tử theo phương pháp Ôgietska [18], ới VK đã nuôi cấy 2 tuần tuổi trên ống nghiên th
t HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn đèn c c.
t bôi miếng giấy lọc rồi nhỏ Fuchsin Ziehl, hơ nóng cho đ c nhuộm cạn phải bổ sung ngay và giữ trong 5 phút.
ửa lại vết bôi bằng nước.
t bôi bằng xanh metylen Loeffler trong 5 – 15 phút. khô tự nhiên vết bôi.
ản trên kính hiển vi với vật kính dầu.
VK Gram dương bắt m safranin) hay đỏ tía
ện theo phương pháp a các chủng VK phân lập n phù này và nhấc lên thấy i ADN trong nhân bị u các sợi nhày nhớt này
, [3] như sau:
ng nghiên thạch và để vết
n đèn cồn cho bốc hơi,
Fuchsin Ziehl, hơ nóng cho đến khi trong 5 phút.
- Kết quả: Bào tử màu đỏ, tế bào chất màu xanh.
2.3.2.4. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của VSV
(a). Khảo sát ảnh hưởng của pH
Để xác định giá trị pH mà tại đó sự sinh trưởng của vi sinh vật đạt tối ưu, chúng tôi tiến hành như sau:
- Nuôi cấy lắc chủng VSV được chọn.
- Pha môi trường nuôi cấy lỏng có thành phần tương tự môi trường phân lập VSV, cho vào 9 bình tam giác khác nhau có cùng thể tích là 100ml dung dịch trên.
- Chuẩn độ pH bằng máy đo pH với các giá trị lần lược 5 đến 8,5. - Hấp khử trùng môi trường ở 1210C trong 20 phút.
- Bổ sung 100µL dung dịch nuôi cấy lỏng VSV lần lược vào 9 bình tam giác
trên.
- Nuôi lắc trong 24h.
- Đếm số lượng tế bào CFU 9 mẫu theo từng giá trị pH.
Xác định khoảng pH mà tại đó chỉ số nhất (VSV nhiều nhất), đó chính là khoảng pH thích hợp cho sự sinh trưởng của VSV.
(b). Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Tương tự như đối với khảo sát ảnh hưởng của pH, tiến hành đặt dung dịch nuôi cấy lỏng đã cấy VSV ở các môi trường nhiệt độ khác nhau: 250C, 280C, 300C, 320C, 350C, 400C. Sau 48h, tiến hành đếm số lượng CFU. Ở khoảng nhiệt độ mà chỉ số CFU đạt giá trị cao nhất (số lượng VSV nhiều nhất) thì đó là khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng phát triển của VSV.
(c). Phương pháp khảo sát thời gian sinh hoạt tính amylase mạnh nhất
Tương tự như “Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh hoạt tính protease của VSV”, tiến hành nuôi cấy lắc VSV trên môi trường lỏng, sau đó theo các mốc thời gian 24h, 48h, 72h lần lượt cho dung dịch nuôi cấy vào lỗ cấy. Sau đó tiến hành các bước tiếp theo như phương pháp trên rồi dựa vào hiệu số đường kính thủy phân và đường kính lỗ thạch (D – d, mm) để xác định được hoạt tính của chủng VSV. Quan
sát (D-d) của các mốc thời gian sinh trưởng, (D-d) càng lớn thì chủng đó có hoạt tính càng mạnh vào thời điểm sinh trưởng đó.
2.3.2.5. Phương pháp định lượng VSV
Nhằm xác định số lượng VSV trên một đơn vị thể tích, chúng tôi sử dụng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường đặc [14].
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường, phân phối vào đĩa petri tương tự như phương pháp phân lập.
- Pha loãng mẫu dung dịch nuôi cấy lỏng với các nồng độ 10-2 đến 10-10.
- Nhỏ 1ml dung dịch ở mỗi độ pha loãng vào đĩa petri, dùng que trang đã khử
trùng trang đều trên bề mặt đĩa. Lặp lại thao tác, 3 đĩa petri ứng với mỗi nồng độ pha loãng.
- Đậy nắp đĩa petri và nuôi cấy trong tủ ấm 30 oC – 40oC.
- Sau 48 – 72h lấy đĩa petri ra và chọn những đĩa petri ở nồng độ pha loãng mà tại đó, số khuẩn lạc trên đĩa petri dao động từ 25 – 250.
- Tính số lượng CFU (Colony Forming Unit: đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1ml mẫu dung dịch ở mỗi độ pha loãng theo công thức:
= . (CFU/ml)
Trong đó:
Mi: tổng số CFU trong 1ml dung dịch ở mỗi độ pha loãng. Ai: số khuẩn lạc trung bình/ đĩa
Di: độ pha loãng mẫu
V: dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình M trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
2.3.2.6. Phương pháp bố trí thử nghiệm xử lý nước thải
Thí nghiệm XLNT bằng VSV được tiến hành trên bể xử lý sinh học Aeroten – pilot KT 11 với tích: Tiến hành pha loãng mẫu 6 lần với nước cất đã chuẩn bị sẵn với dung tích bể đạt 35 lít nước (nước thải + nước cất).
- Cấp khí: dùng 1 bơm thổi khí với công suất 40L/phút đảm bảo lượng oxy hòa tan tối ưu cho quá trình oxy hóa.
- Vận tốc dòng chảy được điều chỉnh nhờ một bơm định lượng sao cho phù hợp với tốc độ oxy hóa, đảm bảo dòng ra đạt tiêu chuẩn thải:
(COD < 150mg/l, BOD5< 50mg/l)
Sau khi bổ sung dung dịch nuôi cấy lắc của chủng VK Bacillus được chọn vào hệ thống xử lý sinh học hiếu khí với tỉ lệ số lượng VK/Vnước thải đã được xác định.
2.3.2.7. Phương pháp phân tích trong quá trình xử lý nước thải
Xác định pH trong nước thải
Đối với chỉ số này, tiến hành xác định bằng máy đo nhanh tự động.
Xác định BOD5 trong nước thải
Xác định BOD5 của mẫu nước thải bằng: Bộ xác định BOD 6 vị trí – BOD Sensor system 6 – Velp.
Cách tiến hành:
- Cho vào lọ ủ BOD5 100ml mẫu nước thải/nước cất. - Thả cục khuấy từ vào lọ và lắp đầu xác định BOD5
- Cài đặt với thông số thích hợp (1000mg/l đối với 100ml mẫu) - Nhấn Start để chạy chương trình đo tự động.
- Sau 5 ngày đọc chỉ số BOD5 thật bằng công thức: Real BOD5 = (a-b) × c (mg/l)
Trong đó: a: chỉ số BOD5 của mẫu nước thải b: chỉ số BOD5 của mẫu nước cất c: độ pha loãng mẫu nước thải.
Phương pháp đo COD trong nước thải
Để xác định COD chúng tôi tiến hành theo phương pháp Hồi lưu kín – Trắc quang (theo: Standar Method, 1999).
Phương pháp xác định Nitơ tổng trong nước thải
Để xác định hàm lượng Nitơ tổng, chúng tôi tiến hành theo phương pháp Kjeldahl (phương pháp chưng cất đạm).
Phương pháp xác định chất rắn lơ lửng trong nước thải
Xác định chất rắn lơ lửng (SS) và chất rắn lơ lửng dể bay hơi (VSS) bằng phương pháp trọng lượng (theo: Standard methods, 1999).
Cách tiến hành:
Chuẩn bị giấy lọc
Sấy giấy lọc và đĩa nhôm ở 103-105oC trong 1 giờ Làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng Cân khối lượng đĩa + giấy lọc (m0, mg)
Lọc mẫu
Lắp giấy lọc, làm ướt bằng một ít nước cất, mở bơm chân không
Rót thể tích mẫu đã tính trước vào phễu(*).
Khi lọc hết mẫu, rửa thành phếu 3 lần với 10 mL nước cất mỗi lần.
Lấy giấy lọc có chất rắn cho vào đĩa nhôm.
Sấy-làm nguội-cân
Sấy đĩa nhôm+giấy lọc trong tủ sấy ở 103-105oC trong 1 giờ Làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng
Cân khối lượng đĩa+giấy lọc+chất rắn.
Lặp lại ‘sấy-làm nguội-cân’ (sấy 30 phút) cho đến khi thay đổi khối lượng không quá 4% so với lượng cân lần trước (m1, mg).
Nung-làm nguội-cân
Cho đĩa nhôm+giấy lọc+SS vào lò nung đã đạt sẵn 550oC, nung trong 15-20 phút
Làm nguội một phần ngoài không khí, rồi trong bình hút ẩm. Cân khối lượng đĩa+giấy lọc+chất rắn.
Lặp lại ‘nung-làm nguội-cân’ (nung 10 phút) cho đến khi thay đổi khối lượng không quá 4% so với lượng cân lần trước (m2, mg).
VS S SS (*) Thể tích mẫu cần lấy sao cholượng chất
rắn giữ lại trong
khoảng 2,5-200
Tính toán: a. SS – 1000 mâu tích thê m m mg/L SS, 1 0 b. VSS – 1000 mâu tích thê m m mg/L VSS, 1 2
Chú ý: Để có kết quả đại diện, cần phân tích lặp lại 2 lần và lấy giá trị trung bình.
2.3.2.8. Phương pháp xử lý số liệu.
Xác định giá trị trung bình:
Giá trị trung bình của các số liệu là tổng giá trị thực của mổi lần đo chia cho số lần đo:
̅ =∑ x
n Trong đó:
: giá trị của một lần đo
x: giá trị trung bình n: số lần đo
Quá trình đo đạc thí nghiệm chúng ta thực hiện lặp lại nhiều lần thì có thể tiếp cận đến giá trị trung bình thật. Nhằm đánh giá giá trị trung bình của các lần đo như là giá trị gần đúng với giá trị trung bình thật, vì thế ta phải sử dụng phương pháp thống kê để đánh giá mức độ chính xác của xác lần đo. Dùng Excel để xử lý số liệu vẻ biểu đồ.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN