Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE trong chọn

THUẬT ĐIỆN DI PROTEIN SDS-PAGE TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA

1.6.1 Kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE

Phương pháp điện di là phương pháp sử dụng một thể đông (gel) bằng tinh bột hoặc Polyacrylamide, trong đó mẫu vật được đặt dọc theo một hàng và điều khiển dòng điện tải qua một dung dịch đệm lỏng. Tùy theo kích thước của vật và điện tích mà các phần tử trong mẫu sẽ phân ly theo hướng cực âm hay cực dương.

Vị trí mà nó thể hiện trên thể gel qua điện di, được phân loại thành nhiều band (vạch). Và sau khi dùng phương pháp nhuộm màu thể gel ta có thể thấy được các band một cách rõ ràng. Dựa vào đó ta có thể so sánh giữa những mẫu vật với nhau để tìm ra những mẫu vật giống và khác nhau, ta có thể gọi giai đoạn này là giai đoạn “đọc gel”.

Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein (Sodium Doecyl Sulfate PolyAcrylamide gel Eclectrophoresis) được Laemmli (1970) phát hiện từ sự hiệu chỉnh bằng cách thêm 0,1% SDS (chất tẩy mang điện tích âm) vào hệ PAGE của Ornstein Davis (1964) nhằm xác định trọng lượng phân tử các loại protein trong phổ điện di (Davis E .Garfin, 1985) bao gồm các bước: ly trích protein, tinh sạch protein, và điện di. Trong dịch ly trích protein thường người ta dùng chất đệm Tris-base (pH >10), chất tẩy SDS, 2-Mercaptoethanol. Khi đun nóng hỗn hợp protein trong dung dịch có

dung dịch đệm SDS (2%) và nhờ vào chất hóa học có gốc thiol (2-Mercapthoethanol) với nồng độ thường là 5%, protein sẽ bị phân cắt các cầu nối

lưu huỳnh và biến tính thành các polypeptide mà vẫn giữ cấu trúc của nó nhờ sự áo của 1,4 g SDS và 1 g polypeptide Ornstein Davis (1964).

Protein dự trữ được sử dụng như các dấu di truyền để tìm hiểu về những protein dự trữ bên trong loài, ảnh hưởng của môi trường, kiểm soát di truyền, tính phức tạp của phân tử và mối quan hệ protein dự trữ giữa các loài khác nhau. Dựa trên phân tích trọng lượng phân tử khác nhau của protein dự trữ mà người ta đánh giá tính đa hình và phổ biến (Phạm Văn Phượng, 2001).

1.6.2 Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE trong chọn tạo giống lúa trong chọn tạo giống lúa

Ứng dụng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE để phân tích các giống lúa có nguồn gốc từ địa phương và các dòng lai. Sau đó tiến hành bố trí thí nghiệm theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 11 giống/dòng lúa và giống Jasmine 85 làm giống đối chứng (thực hiện tại vụ hè năm 2008 tại Nông trại thực nghiệm trường Đại học Cần Thơ). Kết quả là tất cả các dòng đều có mùi thơm, thời gian sinh trưởng ngắn (<100 ngày), ít bị sâu bệnh có năng suất cao hơn giống đối chứng, có hạt gạo dạng thon dài và chất lượng hạt gạo tốt, đạt được mục tiêu đề ra, đáp ứng được tiêu chuẩn gạo xuất khẩu (Hứa Minh Sang và ctv., 2011).

Giống lúa nhập nội từ Úc châu Amaroo có thời gian sinh trưởng ngắn (70-75 ngày) và thấp cây (70-80 cm) được chọn để lai với giống lúa thơm đang trồng phổ biến là Jasmine85-B3. Qua quá trình lai tạo và tuyển chọn kết hợp với kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE kết quả đã chọn ra được 4 dòng lúa thơm và thuần. Trong đó, dòng thuần JasmineTP5-1 có năng suất cao nhất (7,44 tấn/ha), ngắn ngày, kháng bệnh đạo ôn tốt, hàm lượng protein cao (13,3%), hàm lượng amylose thấp (13,5%), và có mùi thơm ổn định (Phạm Văn Phượng và ctv., 2009).

Từ giống nếp NK2 ban đầu thu thập tại địa phương, sau khi được thanh lọc và tuyển chọn bằng phương pháp điện di protein SDS-PAGE theo hướng năng suất cao, chất lượng tốt đã chọn được 5 dòng ưu tú. Đem khảo nghiệm cơ bản 5 dòng ưu tú này với 1 giống đối chứng (nếp NK2 địa phương) tại huyện Phú Tân vào 2 vụ Đông Xuân năm 2008 - 2009, Hè Thu năm 2009. Kết quả đã chọn được dòng đạt mục tiêu đề ra, năng suất cao (6,5-7,5 tấn/ha), có hàm lượng amylose thấp (< 3%), hàm lượng protein cao (> 10%), độ bền thể gel cấp 1 (Võ Công Thành, 2011).

Giống lúa TP9 đã được chọn tạo từ tổ hợp lai KhaoDawkmali x Amaroo có thời gian sinh trưởng ngắn (80-82 ngày) và phẩm chất tốt (hàm lượng protein là 7,2%; hàm lượng amylose là 17,3%) được lai tạo với giống lúa thơm, năng suất cao là TP5 (Jasmine-85 x Amaroo). Kết quả đạt được đến thế hệ F5 đã chọn lọc được 2 dòng lúa thơm, có tiềm năng cho năng suất cao, phẩm chất tốt và thuần bằng phương pháp điện di protein SDS-PAGE. Trong đó dòng thuần THL-13-02-09 có tiềm năng cho năng suất cao nhất (6,7 tấn/ha, vụ Đông Xuân), đồng thời cũng có hàm lượng protein cao (12,8%), hàm lượng amylose thấp (17,5%), hạt gạo rất dài (8,3 mm), có biểu hiện chống chịu sâu bệnh khá và có mùi thơm ổn định (Lê Văn Hòa và ctv., 2011).

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

2.1.1 Thời gian

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 03/2013 đến tháng 08/2014.

2.1.2 Địa điểm

Thí nghiệm được thực hiện tại nhà lưới, phòng thí nghiệm Chọn giống và Ứng dụng Công nghệ sinh học, Bộ môn Di truyền giống nông nghiệp, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu do phòng thí nghiệm Chọn giống và Ứng dụng Công nghệ sinh học, Bộ môn Di truyền giống nông nghiệp, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ cung cấp gồm:

 Cây làm mẹ: THL29 [Amaroo x F3(NK2 x Nhật)] – cây F4.

Cây mẹ có dạng hạt hơi tròn, thời gian sinh trưởng thuộc nhóm cực ngắn ngày (<90 ngày), hàm lượng amylose thuộc phân nhóm rất thấp (3-9%) và hàm lượng protein thuộc phân nhóm cao (>7%) (Bảng 2.1).

 Cây làm cha: THL01 (Sỏi x Nhật) – cây F4.

Cây cha có dạng hạt hơi tròn, có thời gian sinh trưởng thuộc nhóm trung bình (106-120 ngày), hàm lượng amylose thuộc phân nhóm trung bình (20-25%), hàm lượng protein thấp (5,7%) (Bảng 2.1).

Phép lai giữa cây mẹ (THL29) với cây cha (THL01) nhằm rút ngắn thời gian trong công tác chọn giống cũng như tìm ra được tổ hợp lai phù hợp với mục tiêu đề tài đặt ra, bên cạnh đó thì khi lai hai dòng lúa và tổ hợp lai còn có sự phân li về mặt di truyền sẽ tạo cơ hội cho nhà công tác giống có thể tìm ra các tổ hợp lai mới có ý nghĩa.

Bảng 2.1 Một số chỉ tiêu nông học và phẩm chất của cây cha, mẹ ban đầu

Tên giống/dòng TGST (ngày) Amylose (%) Protein (%) Dạng hạt

THL29 87 4,24 9,55 Hơi tròn

THL01 110 23,21 5,7 Hơi tròn

2.2.2 Thiết bị, hóa chất

Hóa chất thí nghiệm: Tris, Acrylamine, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), TEMED, Coomassie Brilliant Blue R250, 2 -Mercapto ethanol (2-ME), KOH, HCl, Iot,…..

Dụng cụ thí nghiệm: Bộ nguồn chạy điện di, khung chạy điện di, kính chạy điện di dạng mini, máy li tâm, cân điện tử, cân phân tích, máy scan….

Dụng cụ lai tạo: kéo, giấy bóng mờ, kẹp,…

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Nội dung nghiên cứu

Bước 1: Nhận giống và trồng cây cha mẹ. Bước 2: Thực hiện tổ hợp lai và thu hạt lai F1. Bước 3: Trồng cây F1 (trong nhà lưới), thu cá thể.

Bước 4: Trồng cây F2 (trong nhà lưới), theo dõi sự phân ly, đánh giá các chỉ tiêu nông học và thu chọn các cá thể ưu tú.

Bước 5: Phân tích các chỉ tiêu nông học và phẩm chất hạt (amylose, protein, độ bền thể gel, nhiệt trở hồ,…) chọn dòng theo hướng phẩm chất tốt.

Bước 6: Điện di protein tổng số các dòng chọn được để kiểm tra độ thuần và chọn ra cá thể không có hay có băng waxy rất nhạt để tiếp tục trồng và theo dõi ở các vụ sau.

2.3.2 Phương pháp lấy chỉ tiêu nông học, thành phần năng suất

2.3.2.1 Chỉ tiêu nông học

Thời gian sinh trưởng (ngày): Là thời gian được tính từ lúc hạt nảy mầm cho

đến khi thu hoạch (khi bông lúa chín từ 85% bông trở lên trên toàn lô). Đối với lúa cấy thì thời gian sinh trưởng được trừ đi 5 ngày (thời gian để cây lúa phục hồi sau khi cấy).

Chiều cao cây (cm): Tiến hành đo chiều cao cây vào lúc chuẩn bị thu hoạch.

Đo từ mặt đất đến chóp bông cao nhất của bụi.

Chiều dài bông (cm): Khi thu hoạch, tiến hành đo chiều dài bông. Đo từ cổ

bông đến chóp bông, đo ngẫu nhiên 3 bông/bụi và tính trung bình.

Chiều dài từng lóng (cm): Đo khoảng cách giữa 2 đốt lóng liên tiếp nhau và

chỉ đo các lóng trên mặt đất. Thứ tự lóng tính từ cổ bông dần xuống gốc, lóng đầu tiên dưới cổ bông là lóng thứ nhất, kế tiếp là lóng thứ hai và cuối cùng là lóng thứ tư hoặc thứ năm, đo 3 chồi/bụi và tính trung bình.

Đường kính lóng (mm): Dùng thước kẹp đo đường kính từng lóng, đo

3 chồi/bụi và tính trung bình.

Độ cứng lóng thân (N/cm²): Được tiến hành đo bằng máy đo độ cứng IMADA

ZP –50N (Torque gauges IMADA) với độ chính xác ± 0,5% FS. Các cây tiến hành đo phải lột hết bẹ. Đo khoảng giữa từng lóng. Mỗi bụi lấy 3 chồi để đo và tính trung

2.3.2.2 Các chỉ tiêu về thành phần năng suất Tổng số chồi: Đếm tổng số chồi lúc thu hoạch.

Số hạt chắc/bông (hạt): Đếm tổng số hạt chắc/bông của 3 bông ngẫu nhiên và

tính trung bình.

Phần trăm hạt chắc (%): Là tỉ lệ giữa số hạt chắc trên bông với tổng số hạt

trên bông. Lấy ngẫu nhiên 3 bông/bụi để tính và tính trung bình.

Trọng lượng 1000 hạt (g): Cân trọng lượng 1000 hạt và quy trọng lượng về độ

ẩm chuẩn (14%). W14%= 86 ) 100 ( ⁰ 0 H W  

Trong đó: W0: Trọng lượng mẫu lúc cân (g)

H⁰ : Ẩm độ lúc cân (%)

W14% : Trọng lượng hạt ở ẩm độ 14% (g)

2.3.3 Phương pháp lai tạo và chọn lọc

Trồng cây cha mẹ: Tiến hành trồng cây cha, mẹ ở trong chậu riêng, chăm sóc

chu đáo để chúng sinh trưởng phát triển tốt, và cũng để tiện cho việc khử đực sau này. Vì có thời gian sinh trưởng dài hơn nên cây cha (THL01) được trồng trước cây mẹ (THL29) khoảng 20 ngày, cây mẹ ta tiến hành trồng 3 lần, mỗi lần cách nhau 10-14 ngày để đảm bảo trổ hoa cùng lúc với cây cha.

Phương pháp khử đực: Chọn bông phải trổ khỏi bẹ khoảng 50-60%, cẩn thận

tách bông được chọn ra khỏi những bông xung quanh để dễ làm, tách bông được chọn ra khỏi bẹ lá.

Chọn các bông phát triển tốt, dùng kéo cắt bỏ tất cả hoa đã nở từ chóp bông (nhị đực đã phơi ra) và hoa còn non ở cuối bông. Mỗi khóm chỉ giữ lại từ 3-4 nhánh, ở mỗi bông chỉ giữ lại từ 15-20 hoa thành thục.

Sau đó, dùng kéo cắt xiên vỏ trấu, bỏ đi từ 1/3 vỏ trấu để lộ ra những túi phấn. Không nên cắt quá thấp dể làm tổn thương nướm nhụy cái, nếu cắt quá cao sẽ khó khử nhị đực và hạt phấn khó rơi xuống nướm nhụy cái.

Loại bỏ nhị đực: Dùng kẹp gấp lần lượt từng bao phấn ra ngoài (6 bao phấn)

phải thật cẩn thận để không làm tổn thương nướm nhụy.

Ghi ký hiệu trên bao: Dùng bao bằng giấy bóng mờ, chi tiết cần ghi: ngày khử

đực, tên người lai, tên tổ hợp lai.

Bao cách ly: Khi cả bông lúa đã được khử, bao cả bông lúa bằng giấy bóng

Hình 2.1 Khử đực cây mẹ vào buổi chiều mát

Phương pháp thụ phấn: Thu thập phấn của cây cha và thụ phấn cho hoa của

cây mẹ đã được khử đực và bao cách li. Thụ phấn vào buổi sáng khoảng 8-10 giờ khi hoa sắp nở hoặc vừa nở dùng kẹp gấp bao phấn, đưa cả bao phấn vào đầu nhụy cái của các hoa đã được khử đực và ấn nhẹ cho bao phấn nứt ra. Sau đó bao cách li lại ghi rõ tổ hợp lai, ngày lai. Chỉ bỏ bao cách li khi hạt đã được hình thành hoàn chỉnh.

Sau khi lai, cây lai cần được theo dõi thường xuyên để ngăn chặn kịp thời côn trùng và động vật phá hại cây lai và hạt lai. Khi hạt lai đã chín cần thu hoạch kịp thời.

2.3.4 Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu phẩm chất hạt gạo

2.3.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng Amylose

Xác định hàm lượng Amylose theo phương pháp Cagampang and Rodriguez (1980).

* Bước 1: Chuẩn bị các dung dịch - Ethanol 95%

- HCl 30% - NaOH 1N

- Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI) * Bước 2: Chuẩn bị mẫu

- Cân 50 mg bột nhũ đã nghiền mịn cho vào ống 50 ml. - Thêm 0,5 ml ethanol 95% lắc nhẹ cho tan đều.

- Thêm 9,5 ml NaOH 1N. Để qua đêm ở nhiệt độ phòng. * Bước 3: Pha loãng mẫu và đo mẫu

- Rút 100 µl dung dịch mẫu cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dung dịch mẫu bằng 100l NaOH 1N).

- Thêm nước cất khoảng 1/2 bình, lắc đều. - Thêm 250 µl HCl 30% lắc đều.

- Thêm nước cất đến vạch định mức.

- Chuyển sang ống 50 ml và lắc đều, để yên 30 phút.

- Lắc đều trước khi đưa vào cuvette. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 580 nm. * Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả

Đường chuẩn có dạng: Y = aX+b Trong đó: Y: Độ hấp thụ OD

X: Lượng amylose có trong 1 ml mẫu, đọc từ máy (%A) Tính hàm lượng amylose theo công thức: % Amylose 100

TLM X

Trong đó: TLM: Trọng lượng mẫu lúc cân quy về ẩm độ 14%

Sau đó đánh giá hàm lượng amylose theo thang đánh giá hàm lượng amylose của IRRI (1988) ở Bảng 2.2

Bảng 2.2 Thang đánh giá hàm lượng amylose (IRRI, 1988)

Phân nhóm Hàm lượng amylose (%)

Gạo nếp 0 - 2 Gạo tẻ: - Rất thấp - Thấp - Trung bình - Cao 3 - 9 10 - 19 20 - 25 >25

2.3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng Protein

Tiến hành theo phương pháp Lowry O.H.et al.,(1951). * Bước 1: Chuẩn bị dung dịch ly trích

- Dung dịch NaOH 0,1N.

- Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,05% + NaOH 0,1N). - Dung dịch B (CuSO4 0,1%).

- Dung dịch C (A:B = 45:5). - Dung dịch Folin 1N

* Bước 2: Chuẩn bị mẫu

- Cân 10 mg bột gạo + 1 ml NaOH 0,1N. - Lắc ít nhất 2 giờ hay để qua đêm.

* Bước 3: Pha loãng mẫu và đo

- Vortex mẫu sau đó ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút.

- Rút 100 µl mẫu cho vào ống 10 ml. Đối với mẫu blank, thay dung dịch ly trích bằng 100 µl NaOH 0,1N.

- Thêm 1 ml nước cất, lắc đều. - Thêm 500 µl dung dịch C.

- Trộn đều và để yên trong 10 phút.

- Thêm 50 µl Folin 1N, trộn đều và để yên trong 30 phút.

- Lắc đều mẫu, sau đó cho vào Cuvette và đo ở bước sóng 580 nm. * Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả

- Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). - Đường chuẩn có dạng: Y = aX + b

Trong đó: Y là Độ hấp thụ OD.

X là Lượng protein có trong mẫu đem đo. - Hàm lượng protein được tính theo công thức:

Phần trăm Protein (%P) = 100

m x

Với: m là trọng lượng thực của mẫu m =

14 100 %) 100 ( 10    H H%: Độ ẩm của mẫu 2.3.4.3 Phương pháp xác định độ bền thể gel

Theo phương pháp của Tang et al.,(1991). * Bước 1: Chuẩn bị mẫu

- Tách vỏ trấu và đo ẩm độ hạt gạo.

- Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%). * Bước 2: Hòa tan mẫu

- Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% thymol blue. - Thêm 2 ml KOH 0,2N. Sau đó khuấy đều bằng máy Vortex.

- Đậy nắp kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 100⁰C) khoảng 8 phút. - Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong nồi nước đá 10 phút. * Bước 3: Đọc và ghi kết quả

- Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chảy từ từ, sau một giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel).

Bảng 2.3 Phân cấp độ bền thể gel (IRRI, 1996)

Cấp Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel

1 80 - 100 Rất mềm 3 61 - 80 Mềm 5 41 - 60 Trung bình 7 35 - 40 Cứng 9 <35 Rất cứng 2.3.4.4 Phương pháp xác định độ trở hồ

Theo phương pháp của Jennings et al.,(1979)