2.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu do phòng thí nghiệm Chọn giống và Ứng dụng Công nghệ sinh học, Bộ môn Di truyền giống nông nghiệp, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ cung cấp gồm:
Cây làm mẹ: THL29 [Amaroo x F3(NK2 x Nhật)] – cây F4.
Cây mẹ có dạng hạt hơi tròn, thời gian sinh trưởng thuộc nhóm cực ngắn ngày (<90 ngày), hàm lượng amylose thuộc phân nhóm rất thấp (3-9%) và hàm lượng protein thuộc phân nhóm cao (>7%) (Bảng 2.1).
Cây làm cha: THL01 (Sỏi x Nhật) – cây F4.
Cây cha có dạng hạt hơi tròn, có thời gian sinh trưởng thuộc nhóm trung bình (106-120 ngày), hàm lượng amylose thuộc phân nhóm trung bình (20-25%), hàm lượng protein thấp (5,7%) (Bảng 2.1).
Phép lai giữa cây mẹ (THL29) với cây cha (THL01) nhằm rút ngắn thời gian trong công tác chọn giống cũng như tìm ra được tổ hợp lai phù hợp với mục tiêu đề tài đặt ra, bên cạnh đó thì khi lai hai dòng lúa và tổ hợp lai còn có sự phân li về mặt di truyền sẽ tạo cơ hội cho nhà công tác giống có thể tìm ra các tổ hợp lai mới có ý nghĩa.
Bảng 2.1 Một số chỉ tiêu nông học và phẩm chất của cây cha, mẹ ban đầu
Tên giống/dòng TGST (ngày) Amylose (%) Protein (%) Dạng hạt
THL29 87 4,24 9,55 Hơi tròn
THL01 110 23,21 5,7 Hơi tròn
2.2.2 Thiết bị, hóa chất
Hóa chất thí nghiệm: Tris, Acrylamine, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), TEMED, Coomassie Brilliant Blue R250, 2 -Mercapto ethanol (2-ME), KOH, HCl, Iot,…..
Dụng cụ thí nghiệm: Bộ nguồn chạy điện di, khung chạy điện di, kính chạy điện di dạng mini, máy li tâm, cân điện tử, cân phân tích, máy scan….
Dụng cụ lai tạo: kéo, giấy bóng mờ, kẹp,…
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Nội dung nghiên cứu
Bước 1: Nhận giống và trồng cây cha mẹ. Bước 2: Thực hiện tổ hợp lai và thu hạt lai F1. Bước 3: Trồng cây F1 (trong nhà lưới), thu cá thể.
Bước 4: Trồng cây F2 (trong nhà lưới), theo dõi sự phân ly, đánh giá các chỉ tiêu nông học và thu chọn các cá thể ưu tú.
Bước 5: Phân tích các chỉ tiêu nông học và phẩm chất hạt (amylose, protein, độ bền thể gel, nhiệt trở hồ,…) chọn dòng theo hướng phẩm chất tốt.
Bước 6: Điện di protein tổng số các dòng chọn được để kiểm tra độ thuần và chọn ra cá thể không có hay có băng waxy rất nhạt để tiếp tục trồng và theo dõi ở các vụ sau.
2.3.2 Phương pháp lấy chỉ tiêu nông học, thành phần năng suất
2.3.2.1 Chỉ tiêu nông học
Thời gian sinh trưởng (ngày): Là thời gian được tính từ lúc hạt nảy mầm cho
đến khi thu hoạch (khi bông lúa chín từ 85% bông trở lên trên toàn lô). Đối với lúa cấy thì thời gian sinh trưởng được trừ đi 5 ngày (thời gian để cây lúa phục hồi sau khi cấy).
Chiều cao cây (cm): Tiến hành đo chiều cao cây vào lúc chuẩn bị thu hoạch.
Đo từ mặt đất đến chóp bông cao nhất của bụi.
Chiều dài bông (cm): Khi thu hoạch, tiến hành đo chiều dài bông. Đo từ cổ
bông đến chóp bông, đo ngẫu nhiên 3 bông/bụi và tính trung bình.
Chiều dài từng lóng (cm): Đo khoảng cách giữa 2 đốt lóng liên tiếp nhau và
chỉ đo các lóng trên mặt đất. Thứ tự lóng tính từ cổ bông dần xuống gốc, lóng đầu tiên dưới cổ bông là lóng thứ nhất, kế tiếp là lóng thứ hai và cuối cùng là lóng thứ tư hoặc thứ năm, đo 3 chồi/bụi và tính trung bình.
Đường kính lóng (mm): Dùng thước kẹp đo đường kính từng lóng, đo
3 chồi/bụi và tính trung bình.
Độ cứng lóng thân (N/cm2): Được tiến hành đo bằng máy đo độ cứng IMADA
ZP –50N (Torque gauges IMADA) với độ chính xác ± 0,5% FS. Các cây tiến hành đo phải lột hết bẹ. Đo khoảng giữa từng lóng. Mỗi bụi lấy 3 chồi để đo và tính trung
2.3.2.2 Các chỉ tiêu về thành phần năng suất Tổng số chồi: Đếm tổng số chồi lúc thu hoạch.
Số hạt chắc/bông (hạt): Đếm tổng số hạt chắc/bông của 3 bông ngẫu nhiên và
tính trung bình.
Phần trăm hạt chắc (%): Là tỉ lệ giữa số hạt chắc trên bông với tổng số hạt
trên bông. Lấy ngẫu nhiên 3 bông/bụi để tính và tính trung bình.
Trọng lượng 1000 hạt (g): Cân trọng lượng 1000 hạt và quy trọng lượng về độ
ẩm chuẩn (14%). W14%= 86 ) 100 ( 0 0 H W
Trong đó: W0: Trọng lượng mẫu lúc cân (g)
H0 : Ẩm độ lúc cân (%)
W14% : Trọng lượng hạt ở ẩm độ 14% (g)
2.3.3 Phương pháp lai tạo và chọn lọc
Trồng cây cha mẹ: Tiến hành trồng cây cha, mẹ ở trong chậu riêng, chăm sóc
chu đáo để chúng sinh trưởng phát triển tốt, và cũng để tiện cho việc khử đực sau này. Vì có thời gian sinh trưởng dài hơn nên cây cha (THL01) được trồng trước cây mẹ (THL29) khoảng 20 ngày, cây mẹ ta tiến hành trồng 3 lần, mỗi lần cách nhau 10-14 ngày để đảm bảo trổ hoa cùng lúc với cây cha.
Phương pháp khử đực: Chọn bông phải trổ khỏi bẹ khoảng 50-60%, cẩn thận
tách bông được chọn ra khỏi những bông xung quanh để dễ làm, tách bông được chọn ra khỏi bẹ lá.
Chọn các bông phát triển tốt, dùng kéo cắt bỏ tất cả hoa đã nở từ chóp bông (nhị đực đã phơi ra) và hoa còn non ở cuối bông. Mỗi khóm chỉ giữ lại từ 3-4 nhánh, ở mỗi bông chỉ giữ lại từ 15-20 hoa thành thục.
Sau đó, dùng kéo cắt xiên vỏ trấu, bỏ đi từ 1/3 vỏ trấu để lộ ra những túi phấn. Không nên cắt quá thấp dể làm tổn thương nướm nhụy cái, nếu cắt quá cao sẽ khó khử nhị đực và hạt phấn khó rơi xuống nướm nhụy cái.
Loại bỏ nhị đực: Dùng kẹp gấp lần lượt từng bao phấn ra ngoài (6 bao phấn)
phải thật cẩn thận để không làm tổn thương nướm nhụy.
Ghi ký hiệu trên bao: Dùng bao bằng giấy bóng mờ, chi tiết cần ghi: ngày khử
đực, tên người lai, tên tổ hợp lai.
Bao cách ly: Khi cả bông lúa đã được khử, bao cả bông lúa bằng giấy bóng
Hình 2.1 Khử đực cây mẹ vào buổi chiều mát
Phương pháp thụ phấn: Thu thập phấn của cây cha và thụ phấn cho hoa của
cây mẹ đã được khử đực và bao cách li. Thụ phấn vào buổi sáng khoảng 8-10 giờ khi hoa sắp nở hoặc vừa nở dùng kẹp gấp bao phấn, đưa cả bao phấn vào đầu nhụy cái của các hoa đã được khử đực và ấn nhẹ cho bao phấn nứt ra. Sau đó bao cách li lại ghi rõ tổ hợp lai, ngày lai. Chỉ bỏ bao cách li khi hạt đã được hình thành hoàn chỉnh.
Sau khi lai, cây lai cần được theo dõi thường xuyên để ngăn chặn kịp thời côn trùng và động vật phá hại cây lai và hạt lai. Khi hạt lai đã chín cần thu hoạch kịp thời.
2.3.4 Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu phẩm chất hạt gạo
2.3.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng Amylose
Xác định hàm lượng Amylose theo phương pháp Cagampang and Rodriguez (1980).
* Bước 1: Chuẩn bị các dung dịch - Ethanol 95%
- HCl 30% - NaOH 1N
- Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI) * Bước 2: Chuẩn bị mẫu
- Cân 50 mg bột nhũ đã nghiền mịn cho vào ống 50 ml. - Thêm 0,5 ml ethanol 95% lắc nhẹ cho tan đều.
- Thêm 9,5 ml NaOH 1N. Để qua đêm ở nhiệt độ phòng. * Bước 3: Pha loãng mẫu và đo mẫu
- Rút 100 µl dung dịch mẫu cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dung dịch mẫu bằng 100l NaOH 1N).
- Thêm nước cất khoảng 1/2 bình, lắc đều. - Thêm 250 µl HCl 30% lắc đều.
- Thêm nước cất đến vạch định mức.
- Chuyển sang ống 50 ml và lắc đều, để yên 30 phút.
- Lắc đều trước khi đưa vào cuvette. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 580 nm. * Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
Đường chuẩn có dạng: Y = aX+b Trong đó: Y: Độ hấp thụ OD
X: Lượng amylose có trong 1 ml mẫu, đọc từ máy (%A) Tính hàm lượng amylose theo công thức: % Amylose 100
TLM X
Trong đó: TLM: Trọng lượng mẫu lúc cân quy về ẩm độ 14%
Sau đó đánh giá hàm lượng amylose theo thang đánh giá hàm lượng amylose của IRRI (1988) ở Bảng 2.2
Bảng 2.2 Thang đánh giá hàm lượng amylose (IRRI, 1988)
Phân nhóm Hàm lượng amylose (%)
Gạo nếp 0 - 2 Gạo tẻ: - Rất thấp - Thấp - Trung bình - Cao 3 - 9 10 - 19 20 - 25 >25
2.3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng Protein
Tiến hành theo phương pháp Lowry O.H.et al.,(1951). * Bước 1: Chuẩn bị dung dịch ly trích
- Dung dịch NaOH 0,1N.
- Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,05% + NaOH 0,1N). - Dung dịch B (CuSO4 0,1%).
- Dung dịch C (A:B = 45:5). - Dung dịch Folin 1N
* Bước 2: Chuẩn bị mẫu
- Cân 10 mg bột gạo + 1 ml NaOH 0,1N. - Lắc ít nhất 2 giờ hay để qua đêm.
* Bước 3: Pha loãng mẫu và đo
- Vortex mẫu sau đó ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
- Rút 100 µl mẫu cho vào ống 10 ml. Đối với mẫu blank, thay dung dịch ly trích bằng 100 µl NaOH 0,1N.
- Thêm 1 ml nước cất, lắc đều. - Thêm 500 µl dung dịch C.
- Trộn đều và để yên trong 10 phút.
- Thêm 50 µl Folin 1N, trộn đều và để yên trong 30 phút.
- Lắc đều mẫu, sau đó cho vào Cuvette và đo ở bước sóng 580 nm. * Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
- Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). - Đường chuẩn có dạng: Y = aX + b
Trong đó: Y là Độ hấp thụ OD.
X là Lượng protein có trong mẫu đem đo. - Hàm lượng protein được tính theo công thức:
Phần trăm Protein (%P) = 100
m x
Với: m là trọng lượng thực của mẫu m =
14 100 %) 100 ( 10 H H%: Độ ẩm của mẫu 2.3.4.3 Phương pháp xác định độ bền thể gel
Theo phương pháp của Tang et al.,(1991). * Bước 1: Chuẩn bị mẫu
- Tách vỏ trấu và đo ẩm độ hạt gạo.
- Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%). * Bước 2: Hòa tan mẫu
- Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% thymol blue. - Thêm 2 ml KOH 0,2N. Sau đó khuấy đều bằng máy Vortex.
- Đậy nắp kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 1000C) khoảng 8 phút. - Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong nồi nước đá 10 phút. * Bước 3: Đọc và ghi kết quả
- Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chảy từ từ, sau một giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel).
Bảng 2.3 Phân cấp độ bền thể gel (IRRI, 1996)
Cấp Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel
1 80 - 100 Rất mềm 3 61 - 80 Mềm 5 41 - 60 Trung bình 7 35 - 40 Cứng 9 <35 Rất cứng 2.3.4.4 Phương pháp xác định độ trở hồ
Theo phương pháp của Jennings et al.,(1979)
- Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống được thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào đĩa petri.
- Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi đĩa.
- Sắp xếp các hạt dang đều ra để mỗi hạt có đủ chỗ nở lan ra. - Đậy đĩa petri, để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Đánh giá độ trở hồ của hạt gạo theo phân cấp độ độ trở hồ của Jennings et al., (1979) được trình bày ở Bảng 2.4
Bảng 2.4 Phân cấp độ độ trở hồ (Jennings et al., 1979)
Cấp Độ lan rộng Độ trở hồ
1 Hạt gạo còn nguyên Cao
2 Hạt gạo phồng lên Cao
3 Hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên hay rõ nét Cao
4 Hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên và nở rộng Trung bình 5 Hạt rã ra, viền hoàn toàn nở rộng Trung bình
6 Hạt tan ra hòa chung với viền Thấp
7 Hạt tan hoàn toàn và quyện vào nhau Thấp
Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức: Cấp trở hồ =
N n xi Trong đó: xi: cấp độ trở hồ n: số hạt có cấp độ trở hồ xi N: số hạt thử nghiệm
2.3.4.5 Phương pháp phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo
Đo chiều dài và chiều rộng của 10 hạt gạo của mỗi giống/dòng bằng cách xếp nối nhau trên giấy kẻ li, lấy giá trị trung bình. Đánh giá theo phân loại hạt gạo của IRRI (1988) ở Bảng 2.5.
Bảng 2.5 Phân loại hạt gạo theo chiều dài và tỉ lệ dài/rộng (IRRI, 1988)
Cấp Dài hạt Dài/rộng hạt
Dạng hạt Chiều dài hạt (mm) Dạng hạt Tỉ lệ dài/rộng hạt (mm)
1 3 5 7 Rất dài Dài Trung bình Ngắn >7,5 6,61 - 7,5 5,51 - 6,6 <5,51 Thon dài Trung bình Hơi tròn Tròn >3 2,1 - 3 1,1 - 2 <1
2.3.5 Phương pháp điện di protein tổng số SDS – PAGE
Bước 1: Chuẩn bị mẫu.
Lấy 3 mg bột nội nhũ nghiền mịn cho vào ống 15 ml. Thêm 100 μl dung dịch ly trích.
Lắc ít nhất 3 giờ hoặc để qua đêm. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút. Bước 2: Làm gel
Tùy theo chiều dài, chiều rộng và độ dày của khuôn làm gel. Đổ gel theo qui trình của Sambrook (1989).
Cài răng lược giữa hai tấm kính của gel để tạo giếng, thêm một giọt nước. Để yên trong 30-60 phút, loại bỏ răng lược, lắp vào khung điện di, cho dung dịch đệm điện di vào ngập các giếng gel.
Bảng 2.6 Công thức pha dung dịch gel
Hóa chất (1 gel) Gel phân tách 12% (ml) Gel cô mẫu 5% (ml)
Nước cất Acrylamide 30% Tris HCl (pH=8,8) 1,5M Tris HCl (pH=6,8) 1M SDS 10% Amonium persulfate 10% TEMED 1.6 2.0 1.3 - 1.1 0.05 0.002 0.68 0.17 - 0.13 0.03 0.01 0.001
Bước 4: Tiến hành điện di
Bơm 10μl dung dịch ly trích mẫu/giếng.
Chạy điện di với điện thế 20V ở gel cô mẫu và 40V ở gel phân tách. Bước 5: Nhuộm và rửa gel
Gel được nhuộm trong 2 giờ bằng dung dịch nhuộm 0,2% Coomassie Brilliant Blue R250.
Rửa gel bằng microwave trong 30 phút. Bước 6: Đọc kết quả, scan và bảo quản mẫu gel
2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel.
Sử dụng phần mềm thống kê SPSS để phân tích phương sai ANOVA và so sánh Duncan.
a b c d e
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 THẾ HỆ F1 CỦA THL34
Sau quá trình lai tạo, kết quả thu được năm hạt lai F1. Lấy năm hạt lai F1 đem trồng riêng từng cá thể trong chậu kết hợp với cây cha, mẹ để làm đối chứng. Trong quá trình trồng tiến hành chăm sóc, theo dõi, lấy chỉ tiêu nông học, thời gian trổ hoa của từng cá thể. Do hạt lai F1 khá ít, khả năng nảy mầm yếu, trong quá trình trồng chăm sóc do ảnh hưởng của thời tiết và sâu bệnh nên chỉ thu được ba cá thể đạt chỉ tiêu mong muốn (Hình 3.1).
Hình 3.1 Cây lai F1 (a, b, c) so với cây cha (d), mẹ (e)
Sau khi thu hoạch, tiến hành tách bỏ vỏ trấu hạt của ba cá thể chọn được để thấy được sự phân ly giữa hạt đục và hạt trong (với ba lần lặp lại, mỗi lần 100 hạt). Vì mục tiêu của đề tài nhằm tạo ra giống có hạt gạo trong, hàm lượng amylose thấp (10-19%) nên đã loại bỏ phần hạt đục. Kết quả ghi nhận sự phân ly của các hạt F1 được thể hiện qua Bảng 3.1
Bảng 3.1 Sự phân ly hạt của các cá thể F1 Lần Số hạt đục Số hạt trong 1 24 76 2 25 75 3 27 73 TB 25 75 TB: Trung bình Hình 3.2 Hạt của thế hệ F1
3.1.1 Một số chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất của thế hệ F1
Sau quá trình trồng, chăm sóc, và theo dõi các chỉ tiêu: thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, chiều dài bông, % hạt chắc, số bông trên bụi… của các cá thể kết quả ghi nhận được thể hiện qua Bảng 3.2.
Thời gian sinh trưởng
Thời gian sinh trưởng của các cá thể F1 trung bình là 99 ngày (Bảng 3.2), dài hơn so với cây mẹ (87 ngày) và ngắn hơn so với cây cha (110 ngày). Thời gian sinh trưởng của các cá thể F1 thể hiện được đặc tính trung gian giữa cây cha và mẹ.