3. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
Mẫu thực vật đƣợc thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu tƣơi sau khi lấy về đƣợc rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400
C. Mẫu đƣợc xử lý tiếp bằng phƣơng pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu đƣợc nêu ở phần thực nghiệm.
2.1.2. Phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất
Để phân tích và phân tách cũng nhƣ phân lập các hợp chất, sử dụng các phƣơng pháp sắc ký nhƣ:
- Sắc ký cột thƣờng, sử dụng silicagel cỡ hạt 230-400/mesh.
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích đƣợc tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm.
Hiện màu: hơi Iot và đèn UV 254 nm. - Các phƣơng pháp kết tinh phân đoạn.
2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất đƣợc khảo sát nhờ sự kết hợp các phƣơng pháp phổ:
- Phổ tử ngoại (UV)
- Phổ khối lƣợng va chạm electron (EI - MS). - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR. - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR.
- Phổ DEPT. - Phổ HSQC. - Phổ HMBC. - Phổ COSY 2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.1. Hoá chất
Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Dung môi đƣợc sử dụng là: metanol (CH- 3OH), n-butanol (C4H9OH), etylaxetat (CH3COOC2H5), axeton (CH3COCH3), nƣớc cất.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetius hoặc trên máy Yanaco MP-S3.
Phổ tử ngoại UV đƣợc ghi trên máy Hitachi UV-3210.
Phổ khối lƣợng EI-MS đƣợc ghi trên máy HP 5989 B-MS với năng lƣợng bắn phá ở 70 eV.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1
H-NMR đƣợc đo trên máy Bruker 500MHz, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY đƣợc đo trên máy Bruker 125 MHz.
2.3. Nghiên cứu các hợp chất 2.3.1. Phân lập các hợp chất 2.3.1. Phân lập các hợp chất
Mẫu lá cây giác đế miên (Goniothalamus tamirensis) thu hái ở Nghệ An vào tháng 4/2009, đƣợc TS Trần Huy Thái (Viện Sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật-Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam) xác định, tiêu bản đƣợc lƣu giữ tại khoa Sinh, Trƣờng Đại học Vinh.
Lá cây giác đế miên (6,0 kg), đƣợc phơi khô, xay nhỏ và ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (7 ngày). Dịch chiết đƣợc cất loại dung môi, cho 314 g cao metanol. Phân bố cao metanol trong nƣớc, sau đó lắc lần lƣợt với n-hexan, etyl axetat và n-butanol. Cất loại dung môi, cho 42, 91, 55 g các cặn dịch chiết tƣơng ứng.
Sơ đồ 2.1: Chiết các phân đoạn trong lá cây giác đế miên
Lá cây giác đế miên (6,0 kg). Cao metanol (314g) Cao hexan (42g) Cao butanol (55g) Cao etylaxetat (91g) - Phân bố trong nƣớc
- Chiết lần lƣợt với etylaxetat, butanol
Sơ đồ 2.2: Tách các hợp chất trong cao etyl axetat của lá cây giác đế miên
Cao etylaxetat (91g) đƣợc phân tách ở trên bằng sắc ký nhồi silicagel, hệ dung môi giải hấp là cloroform : metanol (19:1, 15:1, 10:1, 4:1) thu đƣợc 10 phân đoạn chính. Phân đoạn 3 kết tinh lại nhiều lần thu đƣợc hợp chất A (83mg). Phân đoạn 4 tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột trên silicagel, hệ dung môi rửa giải là cloroform:metanol (10:1) và kết tinh phân đoạn thu đƣợc hợp chất B (32mg).
- Sắc kí cột
cloroform : metanol
(42g)
Phân đoạn 3 Phân đoạn 4
- Sắc kí cột - Sắc kí cột cloroform : metanol Chất 191 (93 mg) Chất A (83 mg) Chất B (32 mg) Cao etylaxetat (91g)
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các hợp chất
Mẫu lá cây giác đế miên (Goniothalamus tamirensis) thu hái ở Nghệ An vào tháng 4/2009, đƣợc TS Trần Huy Thái (Viện Sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật-Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam) xác định, tiêu bản đƣợc lƣu giữ tại khoa Sinh, Trƣờng Đại học Vinh.
Lá cây giác đế miên (6,0 kg), đƣợc phơi khô, xay nhỏ và ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (7 ngày). Dịch chiết đƣợc cất loại dung môi, cho 314 g cao metanol. Phân bố cao metanol trong nƣớc, sau đó lắc lần lƣợt với n-hexan, etyl axetat và n-butanol. Cất loại dung môi, cho 42, 91, 55 g các cặn dịch chiết tƣơng ứng.
Cao etylaxetat (91g) đƣợc phân tách ở trên bằng sắc ký nhồi silicagel, hệ dung môi giải hấp là cloroform : metanol (19:1, 15:1, 10:1, 4:1) thu đƣợc 10 phân đoạn chính. Phân đoạn 3 kết tinh lại nhiều lần thu đƣợc hợp chất A (83mg). Phân đoạn 5 tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột trên silicagel, hệ dung môi rửa giải là cloroform:metanol (10:1) và kết tinh phân đoạn thu đƣợc hợp chất B (32mg).
3.2. Xác định cấu trúc hợp chất A
Hợp chất A là tinh thể hình kim không màu.
Phổ khối lƣợng va chạm electron (EI-MS) cho pic ion phân tử ở m/z
200 [M]+ tƣơng ứng với công thức phân tử C13H12O2. Phổ 1H-NMR xuất hiện multiplet ở 7,31 cho thấy 5 proton thơm của vòng phenyl bị thế đơn (H-2’’- H-6‖).
Hai proton olefinic có cấu hình trans cho tín hiệu ở 6,75 (d, J = 16,0 Hz) và 6,29 (dd, J = 16,0 và 6,5 Hz) gán cho H-2’ and H-1’ tƣơng ứng. Các tín hiệu cộng hƣởng ở 6,94 (dt, J = 9,8 và 4,3 Hz) và 6,10 (dt, J = 9,8 và
1,6 Hz) đƣợc gán cho H-3 và H-4 của phần , chƣa bão hoà -lacton. Một tín hiệu multiplet ở 2,57 tƣơng ứng với 1 allylic metylen (H-5) và 1 proton của cacbon gắn với oxy của nhóm lacton xuất hiện ở 5,12 (H-6). Phổ 13
C- NMR và các phổ DEPT90, DEPT135 của hợp chất 1 cho thấy có 11 tín hiệu tƣơng ứng với 13 nguyên tử cacbon. Tín hiệu ở 163,8 gán cho cacboxyl cacbon (C-2), trong khi tín hiệu 135,8 tƣơng ứng với 1 cacbon bậc 4 (C- 1‖). Hệ vòng thế đơn cho các pic tƣơng đƣơng ở 128,7 và 126,7 gán cho C-3‖/5‖ và C-2‖/6‖ tƣơng ứng. Bốn cacbon olefinic ở 125,7, 133,1, 121,7 và 144,6 tƣơng ứng với C-1’, C-2’, C-3 và C-4. Các tín hiệu metylen cacbon ( 29,9) và oxymetin cacbon ở 77,9 tƣơng ứng với C-5 và C-6.
Bảng 3.1: Số liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất A C DEPT * [3] 2 C 163,8 163,5 3 CH 121,7 121,4 4 CH 144,6 144,4 5 CH2 29,9 29,9 6 CH 77,9 77,8 1’ CH 125,7 125,5 2’ CH 133,1 132,8 1‖ C 135,8 135,5 2‖ CH 126,7 126,5 3‖ CH 128,7 128,4 4‖ CH 128,4 128,1 5‖ CH 128,7 128,4 6‖ CH 126,7 126,5
Từ các số liệu phổ UV, IR, EI-MS, NMR và so sánh với tài liệu [3, 4], hợp chất A đƣợc xác định là goniothalamin.
O O 3 4 5 6 1' 2' 2 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' (A) Goniothalamin
Goniothalamin (A) là hợp chất chính trong hầu hết các loài giác đế (Goniothalamus). Goniothalamin đƣợc cũng đƣợc phân lập lần đầu tiên năm 1967 từ thân cây Cryptocarya caloneura và sau đó nó còn đƣợc tìm thấy trong các loài Trypanosoma cruzi, Cryptocarya moschata, và Bryonopsis laciniosa.
Trong các styryl lacton thì goniothalamin (A) rất đƣợc chú ý vì giá trị các hoạt tính sinh học quan trọng của nó. Chất này cho thấy khả năng diệt trừ nhiều loại ấu trùng (của sâu bọ và muỗi), diệt trừ nấm và vi khuẩn.
Kết quả kiểm tra hoạt tính độc tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thƣ khác nhau cho thấy hợp chất A kháng mạnh đối với ba dòng tế bào ung thƣ là: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ kết tràng. So sánh với vincristin sunfat (vincristin - một alkaloit đƣợc tách ra từ cây dừa cạn) là loại thuốc đƣợc sử dụng phổ bến hiện nay để chữa cả ba loại ung thƣ trên, kết quả cho thấy hợp chất A có tỷ lệ độ độc trên các tế bào ung thƣ vú và ung thƣ kết tràng so với ung thƣ phổi lần lƣợt là 6,83 và 3,69. Trong khi đó tỷ lệ này ở vicristin sulfat đều xấp xỉ 2. Có nghĩa là goniothalamin (A) sử dụng có hiệu quả hơn để chữa trị ung thƣ vú và ung thƣ kết tràng so với việc dùng nó để chữa ung thƣ phổi. Ngoài ra, goniothalamin ít độc đối với các tế bào thƣờng và không gây hại cho màng tế bào.
Những kết quả này rất có giá trị với các nhà hóa dƣợc, nó mở ra triển vọng sản xuất đƣợc các dƣợc phẩm có thể chữa đƣợc hoàn toàn một số bệnh ung thƣ kể trên.
Hình 3.1: Phổ khối lƣợng EI-MS của hợp chất A
Hình 3.3: Phổ 1H - NMR của hợp chất A
Hình 3.5: Phổ 13C - NMR của hợp chất A
Hình 3.6: Phổ 13C - NMR của hợp chất A
Hình 3.7: Phổ DEPT của hợp chất A
3.3. Xác định cấu trúc hợp chất B
Hợp chất B là tinh thể hình kim không màu. Phổ khối lƣợng va chạm electron cho pic ion phân tử ở m/z 234 [M]+
tƣơng ứng với công thức phân tử C13H14O4. Phổ UV cho hấp thụ cực đại ở 209 và 238nm. Phổ IR chứng tỏ sự có mặt của nhóm -lacton (1718 cm-1) và nhóm hydroxyl (3453 cm-1). Phổ 1
H và 13C- NMR cho thấy hợp chất 2 có 1 nhóm phenyl ( 7,22 -7,36 ppm, 5H, m), 3 nhóm oxymetin ( 66,1, 68,3, 74,7), 1 nhóm cacboxyl ( 169,1 ppm) và 2 nhóm metylen ( 24,0 và 36,4 ppm). Với số liệu phổ ở trên có thể dự đoán cấu trúc của B là 1 styryl lacton. Bảng 3.2: Số liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất B C DEPT * [5] 1 CH 74,7 74,7 3 C 169,2 169,2 4 CH2 36,4 36,3 5 CH 66,1 66,1 7 CH 70,5 70,5 8 CH 68,3 68,2 9 CH2 24,0 24,0 1’ C 136,8 136,6 2’ CH 126,2 126,1 3’ CH 128,9 128,9 4’ CH 128,3 127,7 5’ CH 128,9 128,9 6’ CH 126,2 126,1
Từ các số liệu phổ UV, IR, EI-MS, NMR và so sánh với tài liệu [5] đã xác định 2 là 9-deoxygonipypyron. 9-Deoxygonipypyron lần đầu tiên đƣợc phân lập từ loài giác đế (Goniothalamus giganteus) [5].
O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 5' 6' 1' 2' 3' 4' a b a H H O H H O H H H H O H b (B) 9-Deoxygoniopypyron
Hình 3.16: Phổ 1
H-NMR của hợp chất B
Hình 3.17: Phổ 1
Hình 3.18: Phổ 13
C-NMR của hợp chất B
Hình 3.19: Phổ 13
Hình 3.20: Phổ DEPT của hợp chất B
KẾT LUẬN
Nghiên cứu thành phần hoá học lá cây giác đế miên ở Việt Nam chúng tôi đã thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau:
- Bằng các phƣơng pháp ngâm chiết với các dung môi chọn lọc rồi cất thu hồi dung môi đã thu đƣợc các cao tƣơng ứng là cao hexan (42), cao etylaxetat (91g), cao butanol (55g), pha nƣớc.
- Phân lập hợp chất từ cao etyl axetat bằng các phƣơng pháp sắc ký silicagel và kết tinh phân đoạn thu đƣợc chất A và B.
- Đã tiến hành sử dụng các phƣơng pháp phổ hiện đại: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng va chạm electron (EI-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY để xác định cấu trúc hợp chất tách đƣợc. Các kết quả phổ đã cho phép khẳng định chất A là goniothalamin và B là 9-deoxygoniopypyrone.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tiếng Việt
1. Nguyễn Tiến Bân (chủ biên) (2003), Danh mục các loài thực vật Việt Nam, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.
2. Nguyễn Tiến Bân (2000), Họ Na (Annonaceae), Thực vật chí Việt Nam, Flora of Việt Nam, NXB KHKT Hà Nội.
3. Đỗ Huy Bích và các cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB KHKT Hà Nội.
4. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, (2000), tập 1, 277 – 279. 5. Trần Đăng Thạch, Nguyễn Văn Hùng, Thành phần hoá học lá cây giác đế miên (Goniothalamus Tamirensis pierre fin & gagn), Họ na (Annonaceae), Tạp Chí Hoá học, số 4A, 2009.
6. Trần Đăng Thạch, Nguyễn Văn Hùng, Nghiên cứu phân lập các ancaloit từ cây Goniothalamus Tamirensis pierre, Tạp Chí Hoá học, tập 48 (4B) t.423-428, 2010.
7. Trần Đình Thắng, Tạp chí khoa học và công nghệ, số 2A, 2010, Tr.588- 592.
B. Tiếng Anh
8. A. Ulubenlen, G. Topcu, Phytochemistry, Vol 36, No. 4, pp. 971-974, 1994.
9. Andrea sinz, Rudolf mastusch, Thawatchai Santisuk, Suttiporn Chaichana, Vichai Reutraku (1998), Flavonoids from Dasymaschalon scotecpense photochemistry, 47, 1393 – 1396.
10. B. Ahmad, K. Mat – Salleh & Laily B. Din, Sains Malaysiana 38 (3) (2009): 365 – 369.
11. Bui Huu Tai, Vu Thi Huyen, Tran Thu Huong, Nguyen Xuan Nhiem, Eun-Mi Choi, Jeong Ah Kim, Pham Quoc Long, Nguyen Manh Cuong, and Young Ho Kim, New Pyrano-Pyrone from Goniothalamus tamirensis, Chem. Pharm. Bull. 58(4) 521—525 (2010).
12. Chatchai Wattanapiromsakul1, Boonsong Wangsintaweekul, macrophyllus, Songklanakarin, J. Sci. Technol., 2005, 27(Suppl. 2) : 479-487. 13. Claudia B. Brochini, Nidia F. Roque, J. Braz. Chem. Soc., Vol. 11, No. 4, 361-364, 2000.
14. Darren J. Dixon, Steven V. Ley * and Edward W. Tate, A total synthesis of (1)-Goniodiol using an anomeric oxygen-tocarbon
rearrangement, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1998, 3125–3126
15. De-Quan Yu, Chem, vol.71, No.6, pp.1119 – 1122, 1999.
16. Jung Ho Lee, Bull. Korean Chem. Soc. 2006, Vol. 27, No. 12 , 2104 – 2106
17. Noppamas Soonthornchareonnon, Khanit Suwanborirux, Rapepol Bavovada, Chamnan Patarapanich, and John M. Cassady, New Cytotoxic 1- Azaanthraquinones and 3-Aminonaphthoquinone from the Stem Bark of Goniothalamus marcanii, 1999 American Chemical Society and American Society of Pharmacognosy Published on Web 09/16/1999.
18. Patricia de A. Amaral, Julien Petrignet, Nicolas Gouault, J. Braz. Chem. Soc, vol.20, No 9, 1687 – 1697, 2009.
19. Pradit Pradupsri, Chatchanok Loetchutinat, Narong Nuntasaen, American Journal of Applied Sciences 6 (12): 2018-2023, 2009 ISSN 1546-9239
20. Raghao S. Mali, Priya P. Joshi, J. Chem., Perkin Trans. 1, 2002, 371- 376.
21. Si Wang, Sheng Jun Dai, Ruo Yun Chen, Shi Shan Yu, De Quan Yu, Two New Styryllactones from Goniothalamus cheliensis, Chinese chemical letters vol.14, No.5, pp 487 – 488, 2003 & vol 15, No2, pp 191 – 193, 2004.
22. Yawistha Limpipatwattana, Santi Tip-pyang, Suttira Khumkratok, Biochemical systernatics an ecology 36 (2008) 798 – 800.