Theo Webb thì cơ chế esteraza thuỷ phân cơ chất như sau: đầu tiên cơ chất được hấp phụ trên bề mặt enzym. Lực liên kết giữa cơ chất và enzym là lực tĩnh điện và được chia làm 5
có một vai trò hết sức quan trọng bởi hai lý do:
- Thứ nhất nó có chứa hai hệ electron n giàu electron trên vòng naphtalen và benzen tạo ra lực liên kết tĩnh điện yếu hấp phụ lên các vùng của trung tâm hoạt động của enzym.
- Nó tạo ra cấu trúc đặc hiệu về mặt lập thể hướng liên kết este về phía axit amin Ser của trung tâm hoạt động từ đó ANAE có thể xúc tác cho quá trình thuỷ phân.
Quá trình tối ưu hoá cũng cho thấy cấu trúc lập thể của phân tử cơ chất phù hợp với thực nghiệm bởi vì liên kết esste của phân tử cơ chất là liên kết equatorial - là liên kết đặc hiệu về mặt lập thể đối với sự thuỷ phân của ANAE [1, 53, 182]. Cấu trúc lập thể có nhóm axyl hướng ra bên ngoài mặt phẳng phân tử cơ chất đã tạo ra đặc hiệu về mặt không gian của enzym đối với cơ chất. Đổng thời nguyên tử oxy tạo liên kết este nằm trong mặt phẳng vòng vì vậy khả năng cắt đứt liên kết este của enzym là rất thuận lợi về mặt đặc hiệu lập thể cũng như về mặt năng lượng. Bởi vì sau khi cắt đứt liên kết este thì phân tử trở về dạng đồng phẳng hơn so với cấu hình ban đầu (hình 3.4) và dễ dàng tách ra khỏi enzym để ghép đôi với muối điazo.
4.2- VỂ TỐI ƯU HOÁ THỰC NGHIỆM THEO PHƯƠNG PHÁP ĐƠN HỈNH
4.2.1- Về nhiệt độ
Hầu hết các tác giả đều tiến hành ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (25° C). Có một điều lý thú là nhiệt độ tối ưu của phản ứng thu được đúng bằng nhiệt độ của cơ thể người (37° C). Nó cũng phù hợp với các nghiên cứu về mặt lý thuyết bởi hầu hết các enzym trong cơ thể người có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 37° c, ngoài ra khi tăng nhiệt độ thì độ tan của cơ chất trong nước sẽ tăng lên thuận lợi cho phản ứng xảy ra. Về độ tan của cơ chất trong dung dịch chúng ta còn phải kể đến vai trò của dimetyl focmamit là một dung môi dùng để hoà tan cơ chất; song không thể tăng mãi nồng độ của dung môi này bởi sản phẩm thuỷ phân cơ chất cũng tan
4.2.2- Về pH
Kết quả mà chúng tôi thu được (pH=8) cũng phù hợp với tác giả J.Clayen, L.Bitensky và Butcher cho rằng ANAE hoạt động tốt trong vùng pH =7 - 8,5 song cao hơn so với Yam và
c.s (pH=6,ỉ) áp dụng trực tiếp cho kỹ thuật nhuộm ANAE bạch cầu. Như vậy kết quả thực nghiệm hoàn toàn phù hợp với kết quả tính toán lượng tử cho rằng phản ứng có thể thuận lợi nếu tiến hành ở pH từ 7-8 (4.1.1).
4.2.3- Về thời gian
Thời gian nhuộm thu được trong quá trình tối ưu hoá là 1 giờ. Như vậy so với kỹ thuật của J.Chayen và c.s thì thời gian nhuộm đã rút ngắn được 1 giờ, nhưng dài hơn so với Yam và c.s 15 phút [35, 73]. Thời gian nhuộm ngắn hơn so với J.Chayen 1 giờ có thể là do sự khác nhau về nhiệt độ trong quá trình nhuộm. J.Chayen tiến hành nhuộm ở nhiệt độ 25 ° c, còn qua tối ưu hoá thực nghiệm nhiệt độ chúng tôi thu được là 37 °. Do nhiệt độ của quá trình nhuộm tăng, nên nó đẩy nhanh tốc độ của phản ứng enzym theo nguyên lý: khi tăng nhiệt độ lên 10° c thì tốc độ phản ứng được xúc tác bởi enzym tăng lên 2 lần [4, 7].
4.2.4- Về nồng độ cơ chất:
Tốc độ của một phản ứng enzym tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất, muốn cho tốc độ phản ứng enzym đạt tới tốc độ cực đại thì nồng độ cơ chất phải lớn gấp khoảng 100 lần hằng số Michaelis (Km) [7]. Tức là tại đó tất cả mọi enzym có mặt đều kết hợp với cơ chất. Tuy nhiên mỗi enzym chỉ có thể thuỷ phân một số lượng phân tử cơ chất nhất định sau đó giảm dần hoạt tính và hết khả năng thuỷ phân. Vì vậy việc tìm ra nồng độ tới hạn và khả năng thuỷ phân của enzym chính là đã tìm được nồng độ tối ưu. Nồng độ cơ chất trong dung dịch phụ thuộc vào độ tan của cơ chất. Mà ta đã biết khả năng tan của cơ chất trong nước là rất yếu do nó là một este vì vậy nếu tăng nồng độ cơ chất quá mức thì sẽ dẫn tới thừa và gây lãng phí cơ chất. Sau khi tiến hành tối ưu hoá nồng độ cơ chất của phản ứng nhuộm là 2,29. 10 ^ mol/lít. Nồng độ này nhỏ hơn 4,76 lần so với John V. Dacie và S.M Davis và 7,15 lần so với J.Clayen, L.Bitensky và Butcher. Từ chỗ 1 gram cơ chất có thể nhuộm 1000 tiêu bản qua tiến hành làm tối ưu hoá đã có thể nhuộm được 7000 đến 8000
tiêu bản từ đó chúng ta se hạ được giá thành nhuộm và có điểu kiện triển khai rộng rãi kỹ thuật này trong các phòng xét nghiệm huyết học.
4.3 - VỂ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT HOÁ HỌC
4.3.1- vể ảnh hưởng của muối natri halogenua và các ion kim loại
Các muối natri của dãy halogen đều có ảnh hưởng tới khả năng xúc tác cho phản ứng thuỷ phân của ANAE.
- Với muối NaF: NaF gây ức chế chủ yếu lên ANAE của các tế bào thuộc dòng monocytes. Chính vì chỉ tác dụng lên các tế bào dòng monocytes nên điểm chung của tiêu bản chỉ giảm nhẹ khi cho thêm NaF vào dung dịch ủ. Kết quả cũng phù hợp với nghiên cứu của Yam và c.s (1994) cho rằng NaF gây ức chế mạnh ANAE của dòng monocytes còn các dòng tế bào khác thì không bị ảnh hưởng. Tuy vậy nồng độ NaF gây ức chế ANAE trong dung dịch ủ cơ chất (5 mg/ml) mà chúng tôi thu được cao hơn so với Yam và c.s (1,5 mgỉml). Nhờ sự ức chế ANAE bằng NaF mà các nhà Huyết học có thể ứng dụng để phân biệt được ung thư máu dòng monocytes thể M4 và M5 [8, 15, 35].
Với muối NaBr, NaCL thì ở nồng độ thấp <10 mg/ml là chất hoạt hoá đối với ANAE còn ở nồng độ cao hơn thì không ảnh hưởng đến hoạt động của ANAE. Chayen và c.s cũng nhận thấy NaCl, KC1 và CaCl2 là chất hoạt hoá đối với isoenzym ANAE loại A-esteraza [35]. Như vậy để thu được hiệu quả nhuộm cao hơn nên bổ sung thêm muối natri của clo và brom.
Có rất nhiều enzym bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại và đặc biệt là các ion kim loại nặng. Trong đề tài này chúng tôi đã khảo sát hai ion kim loại hoá trị hai là Cu++ và Pb++ dưới dạng muối CuCl2 và Pb(CH3COO)2.
Với ion Pb++ là một ion kim loại nặng theo các tài liệu về hoá sinh học thì nó là một trong các chất ức chế nhiều loại enzym khác nhau [6, 4]. Song kết quả nghiên cứu đã cho thấy ion Pb++ không những không ức chế mà còn là một chất hoạt hoá khi nồng độ lớn hơn 5 mg/ml. Ngược lại với trường hợp hoạt hoá của muối NaBr và NaCl, khi nồng độ của ion Pb++ tăng thì quá trình hoạt hoá ANAE tăng. Như vậy quá trình hoạt hoá tỷ lệ thuận với nồng độ của ion Pb+ + trong dung dịch ủ.
4.3.2- Về ảnh hưởng của các kháng sinh và vitamin
Các chất kháng sinh như cefotaxim và ampixilin là các chất ức chế mạnh ANAE của các tế bào máu có nhân. Ớ nồng độ trên 12,5 mg/ml trong dung dịch ủ cơ chất các chất này ức chế hầu như hoàn toàn ANAE. Tuy vậy riêng cefotaxim 100% chỉ ức chế ANAE của các tế bào có nhân không thuộc dòng bạch cầu đoạn ưa axit. Như vậy có thể dùng cefotaxim như một chất ức chế chỉ thị để phân biệt dòng bạch cầu đoạn ưa axit.
Gentamycin cho nghiệm pháp hai ống dương tính nên không đánh giá được tác dụng của nó lên quá trình nhuộm.
Đối với các vitamin Bj, B,2 gây ức chế tương đối rõ rệt đối với ANAE của các tế bào máu có nhân. Tuy vậy ANAE nhạy cảm với vitamin Bi2 hơn là Vitamin B, bởi nó có khả năng ức chế ở nồng độ rất nhỏ cỡ 50 |!g/ml. Còn ở nồng độ vitamin Bj khoảng 5-10 mg/ml thì ANAE của hầu hết các tế bào máu có nhân đều bị ức chế.
Ngược lại với vitamin B12 và vitamin B| thì vitamin B6 lại là chất hoạt hoá khi ở nồng độ nhỏ hơn 5 mg/ml. Khi thử nghiệm ở nồng độ cao hơn (lOmglml) vitamin B6 không thấy ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của ANAE.
Đối với natriazid là một chất bảo quản chống nấm mốc và vi trùng phát triển ớ nồng độ rất thấp cỡ 1%0. Với nồng độ 0,5 mg/ml thì ANAE của các tế bào máu có nhân bị ức chế gần như hoàn toàn.
Cỏn đối với thuốc bảo vệ thực vật:
Nhóm photpho hữu cơ chúng tôi chọn Bili là một chất hiện nằm trong danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép lưu hành tại Việt Nam hiện nay. Khi bổ sung vào dung dịch ủ cơ chất với nồng độ 2,9% thì hầu hết ANAE của tế bào máu có nhân trở lên mất hoạt tính. Kết quả mà chúng tôi thu được cũng phù hợp với kết quả của RD Newcomb và c.s (1997) là ANAE đã bị mất hoạt tính khi bổ sung các hợp chất có chứa photpho hữu cơ vào dung dịch ủ cơ chất [118].
Đối với các chất bảo vệ thực vật thuộc nhóm clo và carbamat hữu cơ thì sự ức chế cũng rất mạnh. Clorothanonil ở nồng độ 0,5 mg/ml và bassa ở nồng độ 2,9% đều cho phản ứng
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN
o Kết quả tính toán về mặt lượng tử bằng phương pháp tính gần đúng PM3 thuộc phần mềm HYPERCHEM 4.5 đã cho thấy sự phù hợp giữa tính toán lý thuyết và lý thuyết hoá học cơ bản đối với cơ chế động học của phản ứng nhuộm ANAE bằng phương pháp phẩm màu azo. Thông qua tính toán bằng phương pháp hoá học lượng tử đã dự đoán được các yếu tố ảnh hưởng và điều kiện tối un cho phản ứng như sau:
Về mặt nhiệt động học thì phản ứng đi qua một hàng rào thế năng bằng 11,971 kcal/mol và AH°298=-271,647 kcal/mol. pH của dung dịch ủ cơ chất nên tiến hành ở 7-8, tại pH này dạng cân bằng hỗ biến của sản phẩm thuỷ phân cơ chất nằm ở dạng naphtolat và mật độ điện tích electron tại nguyên tử Cị của hợp phần azo bằng -0,313 và nguyên tử N của muối điazo bằng +0,488.
© Kết quả tối ưu hoá thực nghiệm bằng phương pháp đơn hình đã tìm ra được điều
kiện tối ưu cho phản ứng nhuộm ANAE như sau:
Nồng độ cơ chất trong dung dịch nhuộm tối ưu bằng 0,07 mg/ml, pH thu được phù hợp với các tính toán lượng tử ở phần trên và bằng 8. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình nhuộm là 37°c. Thời gian nhuộm là một giờ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Đặng Như Tại: Cơ sở hoá học lập thể, NXBGD, 1998, tr 28.
2. Đặng Văn Giáp: Liên quan giữa cấu trúc - tác dụng và thiết kế phân tử bằng máy vi tính, NXBGD, 1998, tr 98.
3. Lâm Ngọc Thiềm: Giáo trình hoá học lượng tử cơ sở, NXBKHKT, 1999, tl, tr
79.
4. Lê Đức Ngọc: Động học enzym, Khoa Hoá học trường Đại học Khoa học tự nhiên, 1998, tr 59.
5. Lê Đức Ngọc: Nhập môn thực hành phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, ĐHQGHN, 2000, tr 52.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
13. Al-Katib A, Mohammad RM, Khan K, Dan ME, Pettit GR, Sensenbrenner LL: Bryostatin 1-induced modulation of the acute lymphocytesblastic leukemia cell line Reh,./.
Immunother, 1993 Jul, volume 14, issue 1, p.33-42.
14. Atterberry TT, Bumett WT, Chambers JE: Age-related differences in parathion and chlorpyrifos toxicity in male rats: target and nontarget esterase sensitivity and cytochrome P450-mediated metabolism, Toxicol Appl Pharmacol, 1997 Dec, volume 147, issue 2, p.411-8.
15. Awal MD, Saifuddin AK: The effect of long-term exposure to anthio on serum esterases and ruminal microorganisms of male calves, Vet Hum Toxicol, 1994 Jun, volume 36, issue 3, p. 199-202.
16. Bames.A: Acute Leukemias: The F.A.B classification and more, 1998, p.4.
17. Becker A, Bottcher A, Lackner KJ, Fehringer p, Notka F, Aslanidis c, Schmitz G: Purification, cloning, and expression of a human enzyme with acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase activity, which is identical to liver carboxylesterase,
Arterioscler Thromb, 1994 Aug, volume 14, issue 8, p. 1346-
55.
18. Bell A. L, Markey G. M, McCaigue M.D, Middleton. D, McCormick J.A, Wilson A.G, Morris T.C.M.: Heredofamilial deficiency of monocytes esterase in patients with
Morphol, 1993 Sep, volume 31, issue 3, p. 169-73.
22. Blind PJ, Buchler M, Blackberg L, Andersson Y, Uhl W, Beger HG, Hernell O: Carboxylic ester hydrolase. A sensitive serum marker and indicator of severity of acute pancreatitis, hit J Pancreatol, 1991 Jan, volume 8, issue 1, p.65-73.
23. Bogdanffy MS: Biotransformation enzymes in the rodent nasal mucosa: the value of a histochemical approach, Environ Health Perspect, 1990 Apr, volume
85, p. 177-86.
24. Bora PS, Guruge BL, Miller DD, Chaitman BR, Ruyle MS: Purification and characterization of human heart fatty acid ethyl ester synthase/carboxylesterase, J Mol Cell Cardiol, 1997 Jan, volume 29, issue 1, p.425.
25. Brestkin AP, Efimtseva EA, Kuznetsova LP, Nikol'skaia EB, Fridland SV: Features of inhibiting butyrylcholinesterase and carboxylesterase hydrolysis with fluoranhydride esters of beta,beta-diphenylethylphosphonic acid, Biokhimiia, 1996 Mar, volume 61, issue 3, p.472-9.
26. Buat.ML, Landemore.G and Izard.J: Alpha naphtyl acatate estarase activities in guinea pig kurloff cells: a cytochemical and electrophoretic study, , Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 09/01/1988, volume 36, Issue 7, p. 1109.
electron microscopy study of non-specific acid esterase and acid phosphatase activities in human peripheral blood lymphocytes, Scanning Microsc. 1991 Mar, volume 5, issue 1, p. 175-81.
31. Carbone.A, Serra.F.G, Ferrandina.G, Scambia.G, Terrbile.D, Bellantone.R, Piantelli.M, Ranelletti.F.O: Methyl-p-hydroxyphenyllactate-esterase activity in breast cancer: a potentially new prognostic factor in short-term follow-up, Cancer research, 1997, p.5406.
32. Chambers JE, Chambers HW, Snawder JE: Target site bioactivation of the neurotoxic organophosphorus insecticide parathion in partially hepatectomized rats. Life Sci. 1991, volume 48, issue 10, p. 1023-9.
33. Chambers JE, Chambers HW: Time course of inhibition of acetylcholinesterase and aliesterases following parathion and paraoxon exposures in rats, Toxicol Appl Pharmacol. 1990 May, volume 103, issue 3, p.420-9.
34. Champelovier P, Seigneurin D, Bose D, Kolodie L: Image analysis as a tool for quantitative enzyme determination at the cellular level: application for monocytescytic differentiation of the UM-384 cell line, Anal Cell Pathol. 1994 Jul, volume 7, issue 1, p. 11-26.
35. Chaturvedi AK, Kuntz DJ, Rao NG: Metabolic aspects of the toxicology of mixtures of parathion, toxaphene and/or 2,4-D in mice, J Appl Toxicol. 1991 Aug, volume 11, issue 4, p.245-51.
resistant acid phosphatase activity coincides with the in situ expression of osteopontin mRNA, , Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 12/01/1995, volume 43, Issue 12, p. 1193.
40. Cornec.L, Robineau.J, Rolland.J.L, Dietrich.J, Barbier.G: Thermostable esterases screened on hyperthermophilic archaeal and bacterial strains isolated from deep-see hydrothermal vents: Chacterrization of esterase activity of a hypeiTnophilic archaeum, Biotechnol, 1998, p. 104.
41. Dachun W, Jiazhen Z: Localization and quantification of the nonspecific esterase in injured skin for timing of wounds, Forensic Sci Int. 1992 Mar, volume 53, issue 2, p.203- 13.
42. Danks MK, Morton CL, Krull EJ, Cheshire PJ, Richmond LB, Naeve CW, Pawlik CA, Houghton PJ, Potter PM: Comparison of activation of CPT-11 by rabbit and human carboxylesterases for use in enzyme/prodrug therapy, Clin Cancer Res. 1999 Apr, volume 5, issue 4, p.917-24.
43. Diczfalusy MA, Andersson U, Bjorkhem I, Einarsson C, Alexson SE: Microsomal long- chain acyl-CoA thioesterase , issue carboxylesterase ES-4 is regulated by thyroxine, Biochim Biophys Acta. 1999 Jul 9, volume 1439, issue
1, p.40-6.
48. Durrer A, Wernly-Chung GN, Boss G, Testa B: Enzymic hydrolysis of
nicotinate esters: comparison between plasma and liver catalysis, Xenobiotica.
1992 Mar, volume 22, issue 3, p.273-82.
49. Eguchi.M, Furukawa.T, Sugita.K, Ishikawa.K, Mikami.T, Tsunoda.S,
Yoshida.M, Miura.Y: Electron microscopic cytochemical of minimally differentiated