2. Tổng quan tài liệu
3.1 Địa điểm nghiên cứu
Lạng Sơn là một tỉnh miền núi, đồi núi chiếm hơn 80 % diện tích cả tỉnh, có 7 huyện vùng cao, 4 huyện vùng thấp. Để đánh giá khách quan tình hình nhiễm T. evansi
ở trâu bò, dựa trên cơ sở những đặc điểm về địa hình, khí hậu cũng như hệ động thực vật, mật độ phân bố dân cư, trình độ dân trí, tình hình chăn nuôi, dịch bệnh, chúng tôi đã chia địa điểm nghiên cứu làm 2 vùng đại diện cho các vùng sinh thái khác nhau.
Vùng I: Là vùng cao có nhiều đồng cỏ tự nhiên, không có (hoặc rất ít) ruộng, ao, mương ngòi, suối nhỏ. Đại diện là 2 huyện Bình Gia và Văn Lãng.
Vùng II: Là vùng thấp có nhiều ruộng nước, ao, mương ngòi và khe, suối nhỏ. Đại diện là 2 huyện Hữu Lũng và Lộc Bình.
Ở mỗi huyện chúng tôi chọn 2 xã tiến hành lấy mẫu tại các hộ gia đình chăn nuôi trâu, bò.
- Huyện Bình Gia lấy mẫu ở xã Bình La và Minh Khai. - Huyện Văn Lãng lấy mẫu ở xã Trùng Khánh và Hội Hoan. - Huyện Hữu Lũng lấy mẫu ở xã Cai Kinh và Yên Vượng. - Huyện Lộc Bình lấy mẫu ở xã Như Khuê và Đồng Bục. 3.2 Thời gian nghiên cứu
Đề tài được tiến hành từ tháng 12 năm 2007 đến tháng 08 năm 2008. 3.3 Đối tượng nghiên cứu
- Là Trypanosoma evansi ở trâu, bò các lứa tuổi thuộc các vùng nghiên cứu của tỉnh Lạng Sơn.
3.4 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học bệnh Tiên mao trùng do T.evansi ở trâu, bò Lạng Sơn:
+ Điều tra tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu, bò.
+ Điều tra tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu, bò theo vùng, lứa tuổi, giống bò và mùa vụ.
- Xác định thành phần loài và hoạt động của côn trùng môi giới trung gian truyền bệnh ở các địa điểm nghiên cứu.
- Xác định hiệu lực của thuốc Azidin điều trị trâu, bò nhiễm T. evansi ở Lạng Sơn.
- Xây dựng biện pháp phòng chống bệnh Tiên mao trùng trâu bò ở Lạng Sơn.
3.5 Vật liệu nghiên cứu
- T. evansi do Trung Tâm Chẩn đoán thú y Quốc gia cung cấp để làm kháng nguyên.
- Mẫu huyết thanh, máu được lấy từ trâu, bò ở các địa điểm nghiên cứu.
- Các hóa chất, dụng cụ phòng thí nghiệm, động vật thí nghiệm phục vụ công tác chẩn đoán xét nghiệm.
3.6 Phương pháp nghiên cứu
- Thực hiện nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng thường quy hiện đang được áp dụng ở các phòng thí nghiệm ký sinh trùng ở trong nước và trên thế giới.
- Chúng tôi chọn địa điểm nghiên cứu theo phương pháp chọn mẫu phân tầng và chọn mẫu chùm. Tiến hành điều tra tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu, bò theo phương pháp nghiên cứu cắt ngang [31].
hành cố định gia súc, dùng kéo cắt lông và sát trùng bằng cồn vùng lấy máu và dùng kim 16 để lấy máu. Mỗi gia súc sử dụng một bộ dụng cụ lấy mẫu riêng, số hiệu mẫu được ghi chi tiết, các mẫu được bảo quản, vận chuyển ở nhiệt độ lạnh trong phích đá; tủ lạnh.
-Phương pháp lấy huyết thanh: Cho máu chảy từ từ vào thành ống để tránh làm vỡ hồng cầu. Khi lượng máu đạt 4-5ml thì nút bông vào đầu ống nghiệm, sau đó để ống nghiệm nghiêng với một góc 35-45 độ, để ống nghiệm máu ở trong phòng từ 6 -12 giờ sau đó tiến hành chắt huyết thanh.
-Phương pháp lấy máu để tiêm truyền động vật thí nghiệm: máu được lấy cho vào lọ có chứa sẵn chất chống đông là Citrat Natri 3,8%.
3.6.2 Phương pháp chẩn đoán
Mẫu xét nghiệm được tiến hành chẩn đoán tại Phòng chẩn đoán xét nghiệm Chi cục Thú y tỉnh Lạng Sơn bằng các phương pháp sau:
3.6.2.1 Phương pháp ngưng kết SAT (Slide agglutination test) [27]
Đây là phương pháp chẩn đoán dễ tiến hành và nhanh chóng cho kết quả.
-Nguyên lý: trong máu trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng sinh ra ngưng kết tố, có thể là ngưng kết tiên mao trùng thành cụm như hình hoa cúc.
-Các bước tiến hành phản ứng ngưng kết SAT: * Bước 1 Chuẩn bị:
+ Chuẩn bị kháng nguyên là tiên mao trùng sống được lấy từ chuột gây nhiễm tiên mao trùng. Giết chuột có lượng tiên mao trùng tối đa, máu chuột được xử lý bằng Natricitrat 10% (1 ml máu chuột + 0,1 ml Natricitrat).
-Pha loãng kháng nguyên với dung dịch đệm PSG thành nồng độ pha loãng 1/4- 1/8.
+ Huyết thanh chẩn đoán cũng pha loãng ở nồng độ 1/8. * Bước 2: Tiến hành phản ứng:
- Nhỏ một giọt huyết thanh cần chẩn đoán lên phiến kính sạch với một giọt tương đương kháng nguyên. Trộn đều, đậy lá kính trong 5-10 phút, sau đó đọc phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể trên kính hiển vi có độ phóng từ 200-400 lần và đánh giá kết quả phản ứng.
- Phản ứng dương tính: nếu tiên mao trùng chụm lại thành hình hoa cúc (hầu hết tiên mao trùng bị chụm lại thành nhiều cụm hình hoa cúc khắp vi trường kính hiển vi).
- Phản ứng âm tính: tiên mao trùng tản mạn khắp nơi. Nếu một nửa phân tán, một nửa tập trung là phản ứng nghi ngờ.
3.6.2.2 Phương pháp tiêm truyền T. evansi cho chuột bạch [ 27]
- Động vật thí nghiệm là chuột bạch được cắt lông đánh dấu chuột theo số hiệu mẫu.
- Lấy 0,2 ml máu trâu bò nghi mắc bệnh tiêm vào xoang bụng chuột bạch. Theo dõi, kiểm tra từ 1 - 2 tuần nếu trâu bò mắc bệnh Tiên mao trùng thì chuột sẽ có Tiên mao trùng trong máu (khi kiểm tra) và sẽ chết sau khoảng 1 tuần.
- Lấy máu đuôi chuột kiểm tra: cho một giọt máu đuôi chuột trộn với một giọt Citrat Natri 3,8% lên phiến kính, đậy la men, kiểm tra dưới kính hiển vi có độ phóng đại x 100, x 200.
- Kết quả: (+) Dương tính: thấy tiên mao trùng di động bơi trong huyết tương.
(-) Âm tính: Không tìm thấy Tiên mao trùng.
3.6.2.3 Phương pháp nhuộm Giemsa [2 ]
đang sốt.
Dàn máu: Dùng phiến kính khô, sạch đã khử mỡ bằng xà phòng và ngâm trong cồn 96 độ, sấy khô. Lấy giọt máu đường kính chừng 2 - 4 mm. Dùng mép một lá kính phẳng đặt ở phía trái giọt máu, đẩy ngược trên phiến kính, góc giữa phiến kính và lá kính khoảng 40 - 45 độ, sau đó để máu khô tự nhiên. Sau đó cố định tiêu bản bằng cồn Ethylic tuyệt đối hoặc cồn 90 độ. Dùng bút viết nhãn trực tiếp lên phiến kính.
Nhuộm tiêu bản máu: Nhỏ dung dịch giem sa 1/20 - 1/10 ( tuỳ theo thời gian nhuộm nhanh hay chậm) cho ngập phiến kính . Để yên 20 - 30 phút.
Dùng nước cất trung tính để rửa, chú ý không rửa trực tiếp vào chỗ phiến kính.
3.6.3 Phương pháp thu thập và định loài ruồi, mòng hút máu [18]
- Những mẫu ruồi, mòng hút máu được thu thập trên cơ thể trâu bò tại các vùng nghiên cứu.
- Phương pháp thu thập ruồi mòng: dùng vợt làm bằng vải thưa, miệng vợt bằng nhôm cứng có đường kính 10cm, đáy vợt 20 cm. Bắt ruồi, mòng ở những nơi như chuồng gia súc, nơi gia súc nghỉ trưa là cây bóng mát, bãi chăn thả và nơi gia súc làm việc.
- Dùng vợt bắt ruồi mòng, để ruồi mòng bay vào bình độc chứa Kaliciannua khoảng 10-15 phút. Côn trùng chết để ra hộp giấy. Dùng kim nhỏ số 1-2 cắm qua thân ruồi, mòng từ trên xuống ở vị trí 1/3 phía trước và 2/3 phía sau, sau đó cắm kim vào xốp hoặc nút chai, chấn chỉnh tư thế chân, dãn cánh vòi kèm theo nhãn ghi địa điểm thu mẫu, thời gian, loại gia súc, tính biệt, người thu mẫu. Phơi tiêu bản ruồi, mòng ra nắng, tránh gió. Chú ý những tiêu bản mòng hút nhiều máu cần dùng kim chích rìa thân hút máu cho bụng xẹp.
mòng hoạt động mạnh nhất.
- Các mẫu đều được nghiên cứu và định loại theo: Arthur (1960), Ricardo, Stekhoven, Toumanoff, Trịnh Văn Thịnh [36], Từ Hán Đường (1969), Phan Địch Lân [19]
3.6.4 Phương pháp xác định trọng lượng trâu, bò thí nghiệm
Dùng công thức tính trọng lượng trâu, bò thí nghiệm (theo công thức của TS. Nguyễn Văn Thiện, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam).
• Đối với trâu:
TL = 88,4. VN2. DTC • Đối với bò:
TL = 90,0. VN2. DTC TL: là trọng lượng tính bằng kg.
VN: Vòng ngực sau xương bả vai, đơn vị tính là mét, đo bằng thước dây. DTC: Chiều dài thân chéo đo từ điểm trước của khớp xương bả vai đến điểm cuối cùng của u ngồi. Đơn vị tính là mét, đo bằng thước dây.
3.6.5 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Điều tra tình hình nhiễm T. evansi ở đàn trâu, bò tại 4 huyện (8 xã) thuộc 2 vùng sinh thái trong tỉnh.
Các chỉ tiêu nghiên cứu:
- Tỷ lệ nhiễm T. evansi ở đàn trâu, bò nói chung. - Tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu.
- Tỷ lệ nhiễm T. evansi ở bò và tỷ lệ nhiễm theo giống bò. - Kiểm định sự sai khác tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu và bò. - Phân tích đánh giá về tình hình nhiễm T. evansi ở trâu, bò.
-Số lượng trâu, bò nghiên cứu được phân chia theo lứa tuổi để đánh giá một cách khách quan về tình hình nhiễm tiên mao trùng trên trâu, bò tỉnh lạng Sơn.
- Ở các điểm điều tra, đàn trâu, bò được chia làm 3 lứa tuổi, phụ thuộc vào khả năng sinh lý của chúng và khả năng làm việc.
+ Bê nghé từ 1- 3 năm tuổi, đây là gia súc non, cơ thể đang phát triển, nhu cầu dinh dưỡng đòi hỏi cao, được chăm sóc chu đáo, chủ yếu là chăn thả, chưa tham gia việc cày kéo.
+ Trâu bò từ 4 đến 8 năm tuổi có số lượng đông nhất, chúng có vai trò quyết định trong việc cày kéo, sinh sản.
+ Trâu, bò > 8 năm tuổi là dạng già yếu, sống lâu năm trên địa bàn, chịu ảnh lớn của mọi điều kiện chi phối chúng, khả năng cày kéo đã bị hạn chế.
Các chỉ tiêu nghiên cứu:
- Tỷ lệ trâu nhiễm T. evansi theo các lứa tuổi. - Tỷ lệ bò nhiễm T. evansi theo các lứa tuổi.
- Đánh giá: tìm hiểu quy luật nhiễm T. evansi theo các lứa tuổi của trâu, bò.
Thí nghiệm 3: Tình hình nhi ễm T. evansi theo giống của bò tỉnh Lạng Sơn. - Thí nghiệm được tiến hành trên hai giống bò vàng địa phương và bò Lai sind. Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ nhiễm T. evansi theo giống bò.
- Kiểm định sự sai khác tỷ lệ nhiễm T. evansi theo giống bò.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu bò theo vùng sinh thái. Nghiên cứu tình hình nhiễm T. evansi ở trâu bò ở 4 huyện thuộc 2 vùng sinh thái.
- Vùng thấp gồm 2 huyện Hữu Lũng và Lộc Bình. - Vùng cao gồm 2 huyện Bình Gia và Văn Lãng. Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ nhiễm T. evansi ở trâu bò ở trâu, bò theo vùng sinh thái. - Kiểm định sự sai khác tỷ lệ nhiễm T. evansi theo vùng sinh thái. - Tìm hiểu quy luật nhiễm T. evansi ở trâu, bò theo vùng sinh thái
Thí nghiệm 5: Tình hình nhiễm T. evansi ở trâu bò theo mùa.
- Theo dõi tỷ lệ trâu, bò nhiễm T. evansi qua 2 mùa hè thu( từ tháng 5 đến tháng 10 ) và đông xuân ( từ tháng 11 đến tháng 4 ).
- Tìm hiểu quy luật nhiễm T. evansi ở trâu bò theo mùa.
Thí nghiệm 6: Xác định thành phần loài và hoạt động của ruồi, mòng hút máu truyền bệnh Tiên mao trùng tại các địa điểm nghiên cứu.
- Tiến hành thu thập các mẫu ruồi, mòng hút máu trâu, bò tại 8 xã của 4 huyện thuộc 2 vùng sinh thái là vùng thấp và vùng cao. Thời gian tiến hành thu thập mẫu từ tháng 5 và tháng 6 năm 2008.
- Các mẫu ruồi, mòng hút máu được thu thập và định loại theo: Arthur (1960), Ricardo, Stekhoven, Toumanoff, Trịnh Văn Thịnh [36], Từ Hán Đường (1969), Phan Địch Lân [19]
- Tìm hiểu quy luật hoạt động của côn trùng hút máu ở vùng nghiên cứu.
Thí nghiệm 7: Xác định hiệu lực của thuốc Azidin điều trị T. evansi ở trâu, bò tỉnh Lạng Sơn.
- Sau khi xác định được tình hình nhiễm T. evansi ở trâu, bò tỉnh Lạng Sơn, để điều trị hiệu quả trâu bò bị nhiễm T. evansi, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhằm xác định hiệu lực thuốc Azidin điều trị trâu bò bị nhiễm T. evansi.
- Azidin là thuốc trị bệnh ký sinh trùng đường máu do Công ty Cổ phần Dược và vật tư thú y ( Hanvet) sản xuất. Trong 1 lọ Azidin có 1,18 g chứa 525 g Diminazen aceturate. Liều điều trị 5mg/1kg thể trọng. Thuốc được dùng tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch.
- Để đánh giá độ an toàn và hiệu lực điều trị của thuốc chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 5 trâu và 5 bò nhiễm T. evansi qua xét nghiệm.
- Trước khi dùng thuốc, chúng tôi tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu sinh lý như nhịp tim, nhịp thở, thân nhiệt của trâu, bò.
- Sau khi điều trị chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý như nhịp tim, nhịp thở, thân nhiệt của trâu, bò. Theo dõi các phản ứng phụ xảy ra đối với trâu, bò dùng thuốc.
Để xác định hiệu lực điều trị của thuốc Azidin đối với trâu, bò bị nhiễm T. evansi, sau 15 ngày trâu, bò được điều trị, chúng tôi lấy máu tiêm truyền cho chuột bạch để xác định sự tồn tại của T. evansi đối trâu, bò điều trị.
3.6.6 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học và ứng dụng phần mềm máy tính Microsoft Office Excel 2003.
- Để có được giá trị các chỉ số sinh lí của trâu, bò trong thử nghiệm thuốc Azidin chúng tôi sử dụng các công thức sau:
+ Giá trị trung bình của các chỉ số sinh lí:
x : giá trị của các chỉ số sinh lí ở các lần đo và ở các cá thể khác nhau i
(i = 1, 2, 3...)
n
+ Độ lệch chuẩn: S x = ± x + Sai số trung bình: :: ( x , - x) i = 1 ^ Sx m = ±- Vn -1
Để đánh giá sự sai khác về tỷ lệ nhiễm T.evansi ở trâu, bò theo các chỉ tiêu nghiên cứu, chúng tôi sử dụng bảng tương liên kiểm định so sánh giá trị
2
hai hàm: Khi bình phương thực nghiệm (Xtn) và Khi bình phương lý thuyết
2
(Xit) với mức ý nghĩa 0,05 (bậc tự do bằng 1).
2 2
Nếu Xtn< Xitthì kết luận tỷ lệ nhiễm T.evansi giữa 2 chỉ tiêu nghiên cứu là không khác nhau.
2 2
Nếu Xtn > x itthì kết luận tỷ lệ nhiễm T.evansi giữa 2 chỉ tiêu nghiên cứu là khác nhau.
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Vài nét về điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội của tỉnh Lạng Sơn ảnh hưởng đến bệnh Tiên mao trùng trâu, bò
Lạng Sơn là một tỉnh miền núi biên giới nằm ở phía đông bắc Việt Nam, có những đặc thù riêng về vị trí địa lý, khí hậu thời tiết, đất đai, hệ sinh thái và điều kiện kinh tế xã hội. Điều này đã ảnh hưởng rất lớn đến quy luật phát sinh và phát triển dịch bệnh gia súc, gia cầm chăn nuôi tại đây.
4.1.1 Đặc điểm tự nhiên
Lạng Sơn gồm có 10 huyện và 01 thành phố, diện tích tự nhiên 8305,21 km2, từ bắc xuống nam 120 km. từ đông sang tây 125 km.
- Có vị trí từ 20°27'-22°19' vĩ bắc; 106°06'-107°21'’ kinh đông - Phía bắc giáp tỉnh Cao Bằng: 55 km.
- Phía đông bắc giáp Trung Quốc: 253 km. - Phía nam giáp tỉnh Bắc Giang:148 km.
- Phía Đông Nam giáp tỉnh Quảng Ninh: 48 km. - Phía Tây giáp tỉnh Bắc Kạn: 73 km
- Phía Tây Nam giáp tỉnh Thái Nguyên: 60 km.
Đồi núi chiếm hơn 80 % diện tích cả tỉnh. Dạng địa hình phổ biến là núi thấp và đồi, độ cao trung bình so với mực nước biển là 252 m, nơi thấp nhất là 20m ở phía nam huyện Hữu Lũng và nơi cao nhất đỉnh núi nằm trong quần thể núi Mẫu Sơn cao 1541 m.