Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức với 3 lần lặp lại:
Nghiệm thức 1: Ngâm hạt với huyền phù của vi khuẩn đối kháng ở mật số 108 CFU/ml.
Nghiệm thức 2: Chủng vào đất huyền phù của vi khuẩn đối kháng ở mật số 107 CFU/ml.
Nghiệm thức 3: Phun qua lá với huyền phù của vi khuẩn đối kháng ở mật số 107 CFU/ml tại thời điểm 14 NTCB.
Nghiệm thức 4 (đối chứng dương): Phun thuốc hóa học đặc trị bệnh cháy bìa lá đang được nông dân đang sử dụng tại mỗi điểm thí nghiệm.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Nghiệm thức 5 (đối chứng âm): Không xử lý.
Thí nghiệm được chia thành 15 ô, mỗi ô có kích thước 20 m2 (4 x 5m). Các ô thí nghiệm cách nhau 20 – 30 cm. Ruộng thí nghiệm được tách biệt với ruộng lúa xung quanh của nông dân bằng bờ bao (Hình 6). Tổng diện tích thí nghiệm khoảng 300 m2.
1.C 2.B 4.A 5.B 2.A 3.C 4.B 5.C 4.C 1.A 1.B 2.C 3.B 3.A 5.A 5m 4m 20 – 30 cm Bờ bao
Hình 7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tại tỉnh Tiền Giang
Trong đó:
1, 2, 3, 4, 5: Nghiệm thức A, B,C: Số lần lặp lại
Hình 6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tại tỉnh An Giang
4.A 1.B 5.C
2.A 5.A 3.A 1.A
5.B 3.B 2.B 4.C 2.C 1.C 4.B 3.C Bờ bao 5m 4m 20 – 30 cm
Chuyên ngành Vi sinh vật học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 3.2.2. Các bước thực hiện
Chuẩn bị đất: Đất được xới, trục và san phẳng. Đắp bờ ngăn ruộng thí nghiệm và các ruộng xung quanh. Tiến hành phân ô và đánh các rãnh nước như thiết kế. Rút nước ráo mặt ruộng 1 ngày trước khi xạ.
Chuẩn bị dịch huyền phù
Huyền phù vi khuẩn B.stratosphericus: Nuôi vi khuẩn đối kháng trong bình tam giác có chứa môi trường NB (5g NaCl; 3g Beef Extract; 5g peptone; thêm nước cất vào cho đủ 1 lít, chuẩn pH = 6,8) (Shivaji và ctv., 2006) trên máy lắc trong 24 h trước khi sử dụng. Pha loãng huyền phù vi khuẩn đối kháng ở mật số 107 CFU/ml đối với nghiệm thức chủng vào đất, phun qua lá và ở mật số 108 CFU/ml đối với nghiệm thức ngâm hạt.
Huyền phù vi khuẩn Xoo: Vi khuẩn được nuôi trong môi trường Wakimoto cải tiến lỏng (0,5g Ca(NO3)2.4H2O; 0,82g Na2HPO4; 5g peptone, 20g Sucrose; 0,05g FeSO4.7H2O, thêm nước cất vào cho đủ 1 lít, chuẩn pH = 7) (Karganilla và ctv., 1973), trên máy lắc trong 24 giờ.
Chuẩn bị giống: Lúa giống được loại hạt lép, lững trước khi ngâm ủ. Hạt giống được ngâm trong 24 giờ và ủ trong 48 giờ trước khi sạ. Giống được phân chia và sạ theo từng ô. Mật độ sạ là 30kg/ 1000 m2 (theo tập quán của nông dân).
Hình 8: Ruộng thí nghiệm được phân ô và đánh rãnh nước trước khi sạ.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Cách xử lý các nghiệm thức
Nghiệm thức ngâm hạt: Đối với nghiệm thức ngâm hạt, giống đã nảy mầm được ngâm với huyền phù của vi khuẩn B.stratosphericus ở mật số 108 CFU/ml trong 2 giờ trước khi sạ. Lượng huyền phù được sử dụng là 2 lít cho 1kg lúa.
Nghiệm thức chủng vào đất: Trên mỗi ô thí nghiệm phun 600ml huyền phù vi khuẩn đối kháng B.stratosphericus ở mật số 107 CFU/ml tại thời điểm 24h trước khi sạ.
Nghiệm thức phun qua lá: Tiến hành phun dịch huyền phù của vi khuẩn đối kháng có mật số 107 CFU/ml tại thời điểm 14 NTCB. Phun vào chiều mát. Trong quá trình phun dịch huyền phù và các loại thuốc hóa học sử dụng màng nilon che chắn để tránh ảnh hưởng đến các nghiệm thức khác.
Chăm sóc: Tất cả các thao tác gieo trồng, chăm sóc, tưới tiêu, bón phân và phun thuốc bảo vệ thực vật điều thực hiện theo cách của nông dân ở mỗi điểm thí nghiệm. Không sử dụng thuốc trị bệnh cháy bìa lá cho tất cả các nghiệm thức, trừ nghiệm thức đối chứng dương. Ghi nhận nhật ký sử dụng thuốc và phân bón của nông dân.
Chủng bệnh: Pha loãng huyền phù vi khuẩn Xoo về mật số 109 CFU/ml khi chủng bệnh. Vi khuẩn Xoo được phun vào ruộng vào thời điểm 45 ngày sau sạ với liều lượng 600ml/ô.
Lấy chỉ tiêu: Các chỉ tiêu được ghi nhận gồm: Hiệu quả giảm bệnh (tại thời điểm 5, 10 và 15 ngày sau chủng bệnh (Trang 2013), lấy tại 9 điểm như Hình 10, tại mỗi
Hình 9: Phun vi khuẩn Xoo gây bệnh cháy bìa lá vào ruộng thí nghiệm.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học điểm được đặt một khung kim loại có diện tích 400 cm2 (20 x 20 cm))và năng suất, chất lượng hạt (khi lúa chín).
Hiệu quả giảm bệnh
Tỉ lệ chồi nhiễm bệnh được tính theo công thức:
Tỉ lệ lá nhiễm bệnh được tính theo công thức:
Phần trăm diện tích vết bệnh của mỗi lá trong khung được qui về 9 cấp bệnh theo thang đánh giá IRRI (1996) để tính chỉ số bệnh theo công thức (Mc Kinney, 1923): Trong đó: N : tổng số lá điều tra n1 - 9 : Số lá bị bệnh ở cấp tương ứng Số chồi bị nhiễm bệnh Tỉ lệ chồi nhiễm bệnh (%) = x 100 Tổng số chồi Tỉ lệ lá nhiễm bệnh (%) = x 100 Số lá bị nhiễm bệnh Tổng số lá 9.n9 +8.n8 + 7.n7 + 6.n6 + 5.n5 + 4.n4 + 3.n3 +2.n2 +n1 Chỉ số bệnh (%) = x 100 9N
Chuyên ngành Vi sinh vật học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Cấp bệnh được ghi nhận theo thang đánh giá (IRRI, 1996): Cấp 1: lá có diện tích bị bệnh 0 - 3% so với diện tích lá Cấp 2: lá có diện tích bị bệnh 4 - 6% so với diện tích lá Cấp 3: lá có diện tích bị bệnh 7 - 12% so với diện tích lá Cấp 4: lá có diện tích bị bệnh 13 - 25% so với diện tích lá Cấp 5: lá có diện tích bị bệnh 26 - 50% so với diện tích lá Cấp 6: lá có diện tích bị bệnh 51 - 75% so với diện tích lá Cấp 7: lá có diện tích bị bệnh 76 - 87% so với diện tích lá Cấp 8: lá có diện tích bị bệnh 88 - 94% so với diện tích lá Cấp 9: lá có diện tích bị bệnh 95 - 100% so với diện tích lá
Hiệu quả phòng trừ: Được đánh giá thông qua sự chênh lệch về mức độ gây thiệt hại của bệnh trên cây lúa (chỉ số bệnh) ở nghiệm thức áp dụng các biện pháp xử lý theo (Ji et al., 2008).
Trong đó: DS: Chỉ số bệnh (Disease severity) NT: Nghiệm thức.
Năng suất và chất lượng hạt.
DS (NT đối chứng) – DS (NT xử lý)
Hiệu quả PT (%) = x 100 DS (NT đối chứng)
Hình 11: Lấy chỉ tiêu hiệu quả giảm bệnh trên ruộng thí nghiệm tại tỉnh An Giang.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Thu hoạch lúa trong mỗi ô. Cân trọng lượng và đo ẩm độ hạt tại mỗi ô tại thời điểm cân, sau đó quy ra ẩm độ 14% và tính năng xuất thực tế theo công thức sau:
Thu ngẫu nhiên 200 bông/ô, tách toàn bộ hạt (cả hạt chắc và hạt lép). Lấy ngẫu nhiên 20 mẫu từ số hạt trên, mỗi mẫu 10 gram, đếm tổng số hạt, số hạt lem lép. Từ đó tính tỉ lệ lem lép theo công thức:
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
14 100 ) 100 ( %) 14 ( 0 W H W Trong đó: W (14%): trọng lượng ở ẩm độ 14% (kg) W: trọng lượng ở thời điểm cân đo (kg)
H0: ẩm độ của hạt tại thời điểm cân trọng lượng (%)
Trong đó:
NSTT: năng suất thực tế (tấn/ha)
W20m2: trọng lượng của 20m2 ở độ ẩm 14% (kg) 2 2 0 2 1 m W Tỉ lệ lem lép (%) = Số hạt bị lem lép x 100 Tổng số hạt NSTT (tấn/ha)
Chuyên ngành Vi sinh vật học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
4.1. Kết quả khảo sát khả năng phòng trị bệnh cháy bìa lá của vi khuẩn Bacillus stratosphericus trong vụ Hè Thu tại tỉnh An Giang.
4.1.1. Tỉ lệ chồi nhiễm bệnh.
10 NSCB 15 NSCB 5 NSCB
Hình 12: Tỉ lệ chồi nhiễm bệnh vào thời điểm 5, 10, 15 ngày sau chủng bệnh của các nghiệm thức tại An Giang trong vụ Hè Thu năm 2014.
Ghi chú: Các cột ghi phía trên bởi một hoặc nhiều chữ cái giống nhau khác biệt không ý nghĩa ở mức 5% qua phép kiểm định Duncan. Ngày sau chủng bệnh (NSCB), ngâm hạt (NH), phun qua lá (PQL), chủng vào đất (CVĐ), thuốc hóa học (THH), đối chứng (ĐC). NH PQL CVĐ THH ĐC
Chuyên ngành Vi sinh vật học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Kết quả biểu đồ tỉ lệ chồi nhiễm bệnh vào thời điểm 5, 10, 15 NSCB của các nghiệm thức ở Hình 12 thể hiện:
Tại thời điểm 5 NSCB, ở tất cả các nghiệm thức có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh trong khoảng 8,2 – 8,46% đều không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (8,4%), trừ nghiệm thức chủng vào đất có tỉ lệ chồi bệnh là 7,56% tạo được khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng.
Đến thời điểm 10 NSCB, chỉ có hai nghiệm thức thuốc hóa học (8,44%) và nghiệm thức phun qua lá (16,5%) có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh thấp và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (18,25%), trong đó nghiệm thức thuốc hóa học có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh thấp nhất và khác biệt có ý nghĩa với nghiệm thức phun qua lá. Ở thời điểm này nghiệm thức phun qua lá đã thể hiện được hiệu quả giảm bệnh khi có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh thấp và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng trong khi ở thời điểm 5 NSCB thì không có sự khác biệt. Nghiệm thức chủng vào đất không còn duy trì được hiệu quả như tại thời điểm 5 NSCB khi có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh cao 18,16% và không có sự khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức ĐC. Nghiệm thức ngâm hạt có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh 18,2% không thể hiện được hiệu quả giảm bệnh ở thời điểm này.
Thời điểm 15 NSCB, hai nghiệm thức thuốc hóa học (8,85%) và nghiệm thức phun qua lá (26,08%) vẫn duy trì được hiệu quả giảm bệnh khi có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh thấp và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (30,48%). Hai
Chuyên ngành Vi sinh vật học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học nghiệm thức chủng vào đất và ngâm hạt có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh lần lượt là 30,27% và 30,32% không tạo được khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. Từ đó cho thấy nghiệm thức chủng vào đất chỉ có hiệu quả giảm tỉ lệ chồi nhiễm bệnh ở thời điểm 5 NSCB, nhưng không duy trì được hiệu quả ở các ngày tiếp theo. Nghiệm thức ngâm hạt không cho thấy hiệu quả ở chỉ tiêu này.
Kết quả tỉ lệ chồi nhiễm bệnh của các nghiệm thức tại thời điểm 5, 10, 15 NSCB ở Hình 13 cho thấy: có sự lây nhiễm bệnh cháy bìa lá giữa các chồi với nhau nên tỉ lệ chồi nhiễm bệnh ở tất cả các nghiệm thức qua các thời điểm đều tăng.
Giai đoạn 5 – 10 NSCB, nghiệm thức phun qua lá có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh tăng ít nhất (tăng 8,12%) so với nghiệm thức ngâm hạt (tỉ lệ chồi nhiễm bệnh tăng 9,74%) và nghiệm thức chủng vào đất (tỉ lệ chồi nhiễm bệnh tăng 10,6%).
Giai đoạn 10 – 15 NSCB, nghiệm thức phun qua lá có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh tăng 9,58%. Ở giai đoạn này nghiệm thức phun qua lá có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh tăng nhiều hơn so với giai đoạn 5 – 10 NSCB. Tuy nhiên, nghiệm thức PQL vẫn có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh tăng thấp nhất khi so với hai nghiệm thức ngâm hạt (có tỉ lệ chồi bệnh tăng 12,12%) và chủng vào đất (có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh tăng 12,11%).
Ở nghiệm thức chủng vào đất, vi khuẩn B.stratosphericus được chủng vào đất tại thời điểm 1 ngày trước khi sạ. Qua thời gian, lượng vi khuẩn đối kháng này có thể phát triển trong đất hoặc sống nội sinh trong vùng rễ. Khi vi khuẩn Xoo bị rơi xuống đất ruộng trong quá trình chủng bệnh và tấn công vào chồi lúa qua các vết thương ở rễ, chúng sẽ bị vi khuẩn đối kháng sẵn có ở đây tiêu diệt. Ở nghiệm thức này vi khuẩn đối kháng chỉ có trong đất là chủ yếu nên khả năng bảo vệ chồi lúa khi có sự lây truyền bệnh cháy bìa lá thông qua các vết xây xát khi có sự va chạm giữa các chồi, lá bệnh với nhau là rất hạn chế. Do đó nghiệm thức này chỉ có hiệu quả giảm tỉ lệ chồi nhiễm bệnh ở thời điểm 5 NSCB nhưng sau đó không còn duy trì được hiệu quả ở các ngày tiếp theo.
Ở nghiệm thức phun qua lá, vi khuẩn đối kháng B.stratosphericus được phun vào lá tại thời điểm 14 NTCB. Ở nghiệm thức này vi khuẩn đối kháng chủ yếu hiện diện trên lá. Ngoài ra ở thân và vùng rễ vẫn có 1 lượng vi khuẩn B.stratosphericus nhất định do trong quá trình phun vào lá 1 lượng ít vi khuẩn đối kháng sẽ bị rớt vào thân và vùng đất dưới rễ. Lượng vi khuẩn đối kháng này cần thời gian phát triển mới có thể đối kháng lại với vi khuẩn Xoo một cách hiệu quả. Do đó ở thời điểm 5 NSCB nghiệm
Chuyên ngành Vi sinh vật học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học thức này vẫn có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh thấp nhưng không cho khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. Đến thời điểm 10, 15 NSCB lượng vi khuẩn đối kháng đã phát triển đủ mật số để có thể giảm tỉ lệ chồi bệnh hiệu quả.
Về hiệu quả giảm tỉ lệ chồi nhiễm bệnh thì phương pháp phun qua lá là phương pháp có hiệu quả cao nhất so với 2 phương pháp khi có tỉ lệ chồi nhiễm bệnh thấp nhất và duy trì được hiệu quả đến thời điểm 15 NSCB.
4.1.2. Tỉ lệ lá nhiễm bệnh. 10 NSCB 10 NSCB 15 NSCB 5 NSCB NH PQL CVĐ THH ĐC
Hình 14: Tỉ lệ lá nhiễm bệnh vào thời điểm 5, 10, 15 ngày sau chủng bệnh của các nghiệm thức tại An Giang trong vụ Hè Thu năm 2014.
Ghi chú: Các cột ghi phía trên bởi một hoặc nhiều chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa ở mức 5% qua phép kiểm định Duncan. Ngày sau chủng bệnh (NSCB), ngâm hạt (NH), phun qua lá (PQL), chủng vào đất (CVĐ), thuốc hóa học (THH), đối chứng (ĐC).
Chuyên ngành Vi sinh vật học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Kết quả tỉ lệ lá nhiễm bệnh vào thời điểm 5, 10, 15 NSCB của các nghiệm thức trong Hình 14 thể hiện:
Thời điểm 5 NSCB, chỉ có nghiệm thức chủng vào đất có tỉ lệ lá nhiễm bệnh thấp (3,87%), khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức ĐC (4,43%).
Thời điểm 10 NSCB, nghiệm thức phun qua lá (6,19%), thuốc hóa học (4,1%) có tỉ lệ lá nhiễm bệnh thấp và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (6,62%). Tại thời điểm này nghiệm thức phun qua lá bắt đầu thể hiện được hiệu quả giảm bệnh cao hơn thời điểm 5 NSCB khi có tỉ lệ lá nhiễm bệnh ở mức thấp 6,19% và tạo được khác biệt so với nghiệm thức ĐC. Ở thời điểm này nghiệm thức chủng vào đất có tỉ lệ lá nhiễm bệnh là 6,57%, không còn duy trì được hiệu quả giảm tỉ lệ lá nhiễm bệnh như ở thời điểm 5 NSCB. Nghiệm thức ngâm hạt có tỉ lệ lá nhiễm bệnh 6,57%, không tạo được sự khác biệt có ý nghĩa với nghiệm thức đối chứng.
Thời điểm 15 NSCB, nghiệm thức phun qua lá có tỉ lệ lá nhiễm bệnh 7,23%, nghiệm thức thuốc hóa học có tỉ lệ lá nhiễm bệnh 4,19% vẫn duy trì được tỉ lệ lá nhiễm bệnh thấp và khác biệt so với nghiệm thức đối chứng (7,67%). Trong khi nghiệm thức chủng vào đất (7,64%) và ngâm hạt (7,65%) vẫn không thể hiện được hiệu quả giảm bệnh ở thời điểm này.
Kết quả biểu đồ tỉ lệ lá nhiễm bệnh của các nghiệm thức tại thời điểm 5, 10, 15 NSCB trong Hình 15 cho thấy:
Chuyên ngành Vi sinh vật học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Có sự lây truyền bệnh cháy bìa lá giữa các lá trong cùng ô thí nghiệm với nhau. Do đó trong giai đoạn 5 – 15 NSCB ở tất cả các nghiệm thức đều có tỉ lệ lá nhiễm bệnh tăng.
Giai đoạn 5 – 10 NSCB, so với hai nghiệm thức ngâm hạt có tỉ lệ lá nhiễm bệnh tăng 2,37% và chủng vào đất có tỉ lệ lá nhiễm bệnh tăng 2,7% thì nghiệm thức phun