Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phố biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các họp chất hữu cơ nói chung và các họp chất thiên nhiên nói riêng.
1.5.1. Đặc điếm chung của phương pháp sắc k í
Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh.
do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết ỉóp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.
1.5.2. Cơ sở của phương pháp sắc k í
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. Ớ điều kiện nhiệt độ không đối, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
ĩioc.b.C n _ l+b.c
n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n oo : Lượng cực đại của chất có thê bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó.
b : Hằng số.
c : Nồng độ của chất bị hấp phụ.
1.5.3. Phân loại các phương pháp sắc k í
Trong phương pháp sắc kí: Pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể nạp nén vào trong một cột
+ Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang
- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất khí: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí. Trong truờng hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ. + Pha động là chất lỏng: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký
lóp mỏng, sắc ký cột.
• Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tựợng xảy ra trong quá trình phân tách chất.
- Sắc kỷ phân chia (partition chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất long này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.
- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography) + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
- Sắc kỷ trao đồi ion (Ion exchange chromatography) + Pha động chỉ có thê là chất lỏng
- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography, gel filtration chromatography)
+ Pha động chỉ có thê là chất lỏng.
+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng.
- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)
+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein.
- Sắc ký lỏng cao áp
+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và năng phân tách được tăng như thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác dẫn đến khả lên đáng kế. Bởi vì cột được làm tò vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích họp.
• Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration)
- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin - layer chromatography). Trong sắc ký giấy:
+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos + Pha động: là chất lỏng
+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng
- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)
+ Sắc ký cột hở cố điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa.
+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mau cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh
+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí.
Dựa vào cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm nhỏ: sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng.
1.5.3.1. Sắc kỉ cột (c. C)
Đây là phương pháp sắc kí phố biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ.Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại.Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhở thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được).Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là R f , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng. Tuỳ theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 - 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30.
Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng.Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau.Neu lượng chất nhiều và chạy thô thì phô biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Neu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: - Cách 1: Nhồi cột khô.
Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm đế gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột.Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt.
Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột không được nút, gãy, dò.
1.5.3.2. Sắc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng đế kiểm tra và định hướng cho sắc kí cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica gel dày hon), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí, người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được tùng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc s ử dụng dung dịch H 2 S O 4 10%.
1.6. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phô kết hợp.Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của tùng chất mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể.cấu trúc càng phức tạp thi yêu cầu phối hợp các phương pháp phố càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp sắc kí so sánh... [3,4].
1.6.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, ỈR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi
tay, được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hiện nay, thông tin chung thu được từ phố hồng ngoại không nhiều, mà lượng chất cần để thực hiện phép đo này lại cần đến 2 - 3 mg chất và khó thu hồi lại. Vì vậy, thường đối với các hợp chất thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phố hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác.
1.6.2. Phế cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR)
Phố cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phố hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay.Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phố NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kê cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phố NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (^H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học (chemical shift).Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
1.6.2.1. Phổ 'H-NMR
Trong phổ ’H-NMR, độ dịch chuyển hoá học (ô) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển ho á học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
1.6.2.2. Phổ 1SC-NMR
Phố này cho tín hiệu vạch phố cacbon.Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phố khác nhau. Thang đo của phố I3C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm.
1.6.2.3. Phô DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)
Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau.Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất.Tín hiệu của CH và CH3
nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135°.Trên phổ DEPT 90° chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH.
1.6.2.4. Phổ 2D-NMR
Đây là các kỹ thuật phố hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phô HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)'. Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phố này. Trên phổ, một trục là phổ 'H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phồ 'H-'H c o s y (HOMOCOSY) ( 'H - H Chemical S h if Correlation Spectroscopy): Phố này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phồ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phố NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng phố X-RAY (nhiễu xạ Rơnghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của họp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhưng phạm vi sử dụng của phồ này hạn chế vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phố biến đối với các hợp chất hữu cơ.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phô, người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh, kết họp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phố NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.
C H Ư Ơ N G 2. Đ Ó I T Ư Ợ N G V À
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. Mẩu thực vật
Mầu cây Antidesma Acỉdum thu tại Lâm Đồng vào tháng 3 năm 2014 và được
TS. Nguyễn Quốc Bình- Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam giám định. Mầu tiêu bản lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phân lập các hợp chất
2.2.1. Sắc k í lóp mỏng (TLC)
Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Marck 1,05715), R P]8 F254S (Merck). Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4
1 0% được phun đếu trên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ tới khi xuất hiện màu.
2.2.2. Sắc k í lớp mỏng điều chế
Sắc kí lớp mỏng điếu chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silicagel 60G F254 (Merck, kí hiệu là 105875), phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch là H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vết chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp silicagel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích họp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3. Phưong pháp xác định cấu trúc hóa học của các họp chất
2.3.1. Điếm nóng chảy (Mp)
Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học.
2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 'H-NMR (500 MHz) và l3C-NMR (125MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR spectrorneter, Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4. Hóa chất thiết bị
Sắc kỷ lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck); phát hiện chất bằngđèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.
Sắc ký cột (CC): Được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha