Coumarin là những dẫn chất a- pyron có cấu trúc C6- C3.
o
Ot,-pyron Benz» a -p y ro n
Benzo a-pyron là chất coumarin đơn giản nhất tồn tại trong thực vật được biết từ năm 1820 trong hạt của cây Dipteryx odorata Willd thuộc họ Đậu. Cây này mọc ở Brazil, có trồng ở Venezuela và còn có tên địa phương là " Coumarou", do đó mà có tên coumarin. Benzo a-pyron còn có trong lá cây Asperula odorata L. họ Cà phê, trong một số cây thuộc chi Melilotus họ Đậu. Chất này có mùi thơm dễ chịu, được dùng làm hương liệu. Trong kỹ nghệ, benzo a - pyron được tông họp từ aldehyd salicylic, anhydrid acetic và natri acetat. ị p Ỵ ™ 0 (CH,00)30 # NaCH5ODO H Q CDOHa OH OH ^ o o
Người ta có thể coi a-pyron là một lacton (este nội) của acid hydroxy- cinnamic vì khi cho tác dụng acid vô cơ lên acid hydroxycinnamic, ví dụ HC1 thì sẽ đóng vòng lacton. Ngược lại, vòng lacton sê bị mở vòng khi tác dụng bởi kiềm. Sự mở vòng và đóng vòng có tính thuận nghịch. Đứng về mặt sinh nguyên, sự tạo thành coumarin cũng qua con đường acid shikimic rồi tạo thành acid prefenic.
Acid hydroxy cinnam ic
1.3.2. Đặc điấn cấu trúc
Qua hầu hết các chất thuộc các nhóm coumarin ta luôn luôn thấy có nguyên tử oxy nối vào C-7 nên có thê coi tất cả các dẫn chất coumarin đều xuất phát tù’ umbelliferon .
Coumarin thuộc nhóm các hợp chất phenol nhưng phần lớn các nhóm OH phenol được ether hóa bằng nhóm CH3 hay bằng một mạch terpenoid có từ 1-3 đơn vị isoprenoid.
Trong tự nhiên, coumarin ít tồn tại dạng glycosid, nếu có thì mạch đường thường đơn giản, hay gặp là glucose, đôi khi là glc-glc hoặc glc-xyl. Trong nhóm dihydroíuranocoumarin và dihydropyranocoumarin người ta đã phân lập được nhiều dẫn chất acyl. Những dẫn chất acylcoumarin này trước đây thường bị bỏ qua trong quá trình chiết xuất vì rất dề bị thủy phân đặc biệt ở môi trường kiềm. Các acid tham gia để tạo thành ester hay gặp là acid acetic, angelic, tiglic, isovalerianic, 2-methyl butyric.
1.4. Các phưong pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.4.1. Chọn dung môi chiết
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau.Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm.Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển ho á thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.
Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat. Những chất này có thê lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Methanol và chloroírom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)- phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat].Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bấn dịch chiết của cây. Chlrofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa...
khác.Chlorofrom có thể gây tồn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của chlorofrom thấp hơn, nó có thể rủa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô tù’ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nố.Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-40°C, với một vài hoá chất chịu nhiệtcó thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.4.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. - Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ:
- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thê biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết họp lí nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lóp chất ngay trong quá trình chiết.
1.5. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ
Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phố biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các họp chất hữu cơ nói chung và các họp chất thiên nhiên nói riêng.
1.5.1. Đặc điếm chung của phương pháp sắc k í
Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh.
do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết ỉóp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.
1.5.2. Cơ sở của phương pháp sắc k í
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. Ớ điều kiện nhiệt độ không đối, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
ĩioc.b.C n _ l+b.c
n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n oo : Lượng cực đại của chất có thê bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó.
b : Hằng số.
c : Nồng độ của chất bị hấp phụ.
1.5.3. Phân loại các phương pháp sắc k í
Trong phương pháp sắc kí: Pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể nạp nén vào trong một cột
+ Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang
- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất khí: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí. Trong truờng hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ. + Pha động là chất lỏng: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký
lóp mỏng, sắc ký cột.
• Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tựợng xảy ra trong quá trình phân tách chất.
- Sắc kỷ phân chia (partition chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất long này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.
- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography) + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
- Sắc kỷ trao đồi ion (Ion exchange chromatography) + Pha động chỉ có thê là chất lỏng
- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography, gel filtration chromatography)
+ Pha động chỉ có thê là chất lỏng.
+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng.
- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)
+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở.
+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein.
- Sắc ký lỏng cao áp
+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và năng phân tách được tăng như thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác dẫn đến khả lên đáng kế. Bởi vì cột được làm tò vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích họp.
• Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration)
- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin - layer chromatography). Trong sắc ký giấy:
+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos + Pha động: là chất lỏng
+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng
- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)
+ Sắc ký cột hở cố điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa.
+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mau cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh
+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột
Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí.
Dựa vào cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm nhỏ: sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng.
1.5.3.1. Sắc kỉ cột (c. C)
Đây là phương pháp sắc kí phố biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ.Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại.Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhở thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được).Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là R f , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng. Tuỳ theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 - 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30.
Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng.Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau.Neu lượng chất nhiều và chạy thô thì phô biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Neu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: - Cách 1: Nhồi cột khô.
Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm đế gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột.Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt.
Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột