Sắc kỷ lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck); phát hiện chất bằngđèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.
Sắc ký cột (CC): Được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040 - 0,063 mm (240 - 430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30 - 50 Ịim, FuJisilisa Chemical Ltd.).
Phơ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bmker AM500 của Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
C H Ư Ơ N G 3. T H Ụ C N G H IỆ M 3.1. Phân lập hợp chất
Mầu cây Antidesma Acidum được phơi khô, nghiền thành bột (4,0 kg), ngâm chiết với metanol ba lần, sau đó loại dung môi thu được 2 0 0 g cặn chiết metanol. Cặn này được hoà tan vào 3 lít nước cất và chiết lần lượt bằng hexan, clorofoc và etyl axeat. Sau khi loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn hexan (30 g), clorofoc (50 g), etyl axetat (35 g) và nước (45 g).
Cặn clorofoc được tấm vào 110 g Silica gel, cô đuối dung môi cho đến khi thu được bột tơi, khô sau đó tiến hành phân lập bằng sắc ký cột nhồi Silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi hexan/aceton với độ phân cực tăng dần (từ 50/1 - 2/1, v/v) thu được 4 phân đoạn chính là F1 (10,0 g), F2 (5,0 g), F3 (10,7 g) và F4 (10,0 g). Phân đoạn F2 (5,0 g) được tiến hành sắc ký trên cột nhồi Silica gel với hệ dung môi rửa giải là hexan/aceton (4/1, v/v) thu được hợp chất 1 (9 mg). Phân đoạn F3 (10,7 g) được tiếp tục phân lập bằng sắc ký cột Silica gel với hệ dung môi rửa giải là hexan/aceton (2/1, v/v) thu được 4 phân đoạn F3A (1,5 g), F3B (1,4 g), F3C (2,7 g) và F3D (1,6 g). Phân đoạn F3A (1,5 g) được phân lập bằng cột Silica gel với hệ dung môi axeton/nước (1/1, v/v) thu được hợp chất 2 (25 mg) và hợp chất 3 (35 mg).
5-demethyltoddaculin(l),bột vô định hình, màu vàng,Mp 93-94°C; Công thức phân tử: C l5H,604 (M=260); 'H-NMR (500 MHz, DMSO) và l3C- NMR (125 MHz, DMSO): xem bảng 1.
Antidesma acidum ( 4.0 kg)
Ngâm Metano 13 lần
Cặn MeOH ( 200g)
Chiết phân bố với Clrofoc etyl axeat
n-hexan CHCI3 EtOAc H20
___________ I Silicagel C.C,H/A(50/ 1- 2/1)
F l F2 F3 F4
Silicagel C.C,H/A(4/1) Silicagel C.C,H/A(2/1)
H C l(19m g)
F3A F3B F3C
Silicagel C.C,AAV(1/1)
F3D
HC2 (25mg) HC3 (35mg)
C H Ư Ơ N G 4. K É T Q U Ả VÀ T H Ẫ O L U Ậ N 4.1. Xác định cấu trúc hợp chất 1.
Phổ 'H-NMR (trong dung môi DMSO-d6) của hợp chất 1 cho thấy các tín hiệu của 3 proton olefin tại ÔH 5,08 (1H, t, J - 7,0 Hz), 6,16 (1H, á, J =
10,0 Hz) và 8,16 (1H, d, J = 10,0 Hz), 1 proton vòng thơm tại ỖH 6,75 (1H, s),
6 proton của 2 nhóm methyl liên kết với cacbon bậc 4 tại ÔH 1,60 (3H, s ) và 1,70 (3H, s), 1 nhóm methoxyl tại ÔH 3,83 (3H, s).
Phố cacbon và DEPT của hợp chất 1 xuất hiện 15 tín hiệu cacbon với 7 tín hiệu cacbon bậc 4, 4 tín hiệu cacbon bậc 3, 1 tín hiệu cacbon bậc 2, 2 tín hiệu nhóm methyl bậc 4 và 1 tín hiệu nhóm methoxy.
DEPT90 Hình 4.3:Phổ l3C-NMR hợp chất 1 2 10 20« I M I M 1 1« I M 1S« 1 4 « I M 12« tie 100 K DEPT135 CHtCH3 I ■0 10 u ao 40 M 20 CH2 2 10 2 0 « I M I M 1 1 * I M ISO 140 I M 120 1 10 I M M 10 10 «O M 40 M 20 C13CPD i l 2 1 9 ¿00 1 * « ISO 1 1 9 1«0 15« 140 ISO 120 110 1 0« 90 «0 70 M so 40 so 20 ppm
về độ dịch chuyển hóa học chủ yếu ở các vị trí C-5, C-6, C-7, C-4a và C -8a là do sự xuất hiện thêm 1 nhóm methoxy trong hợp chất 1 và sử dụng dung môi đo phổ khác nhau.Trên phố của hợp chất 1 xuất hiện các tín hiệu đặc trung của nhánh isoprenyl tại các vị trícộng hưởng ôc 21,73/ ÔH 3,28 (2H, d, J - 7,0 Hz); ôc 122,46/ ỖH 5,08 (1H, t, J=7,0Hz); 5C 130,57; ôc 17,64/ ỖH 1,60 (3H, s) và ôc 25,44/ SH 1,70 (3H, s) chứng tỏ đã có sự mở vòng trong họp chất 1. Các tín hiệu đặc trưng cho nối đôi của hợp chất dạng coumarin được quan sát thấy tại các vị trí cộng hưởng 5C 139,89/ ỖH 8,16 (1H, d, J= 10,0 Hz) và 5C 109,98/ ôh 6,16 (1H, d, J - 10,0 Hz). Trên phổ 2 chiều HMBC xuất hiện các tương tác của tín hiệu proton 6,16 (H-3) với tín hiệu cacbon 160.45 (C-2) và 103,50 (C- 4a); tín hiệu proton 8,16 (H-4) với các tín hiệu cacbon 160,45 (C-2), 151,85 (C-5) và 154,25(C-8a); tín hiệu proton 3,28 (H-T) với các tín hiệu cacbon 151,85 (C-5), 112,88(C-6), 161,1 l(C-7), 122,46 (C-2’), 130,57 (C-3’) và tín hiệu proton nhóm methoxy với tín hiệu cacbon 161,11(C-7) cho phép khẳng định nhóm methoxy được gắn với cacbon C-7, nhánh isoprenyl được gắn với cacbon C-6. Từ các kết quả phân tích trên có thể khắng định hợp chất lchính là 5-demethyltoddaculin [32].
Hình 4.5Phổ 2 chiều HSQC của họp chất 1 _____________1 .11.,, 1 1 J I . I . . I 1 3! I I I m • m • • ♦ ♦ • y ____
Bảng 4.1 Số liệu NMR của hợp chất 1 và các số liệu tham khảo
c ffôcm ôc3’1DEPT ỏHa,D (mult., J = Hz) HMBC (H—>C)
2 160.7 160.45 c - 3 111.8 109.98 CH 6.16 (d, 10.0) 2, 4a 4 138.6 139.89 CH 8.16 (d, 10.0) 2, 5, 8a 4a 106.7 103.50 c - 5 154.2 151.85 c - 6 119.9 112.88 c - 7 161.3 161.11 c - 8 95.0 91.56 CH 6.57 (s) 4a, 6, 7, 8a 8a 154.8 154.25 c - 7- OMe 55.8 56.12 c h3 3.83 (s) 7 1’ 22.5 21.73 c h2 3.28 (d, 7.0) 5,6,7, 2', 3' 2' 121.9 122.46 CH 5.08 (t, 7.0) 1 \4 ' 3' 131.5 130.57 c - 4' 17.6 17.64 c h3 1.60 (s) 2', 3', 5' 5' 25.5 25.44 c h3 1.70 (s) 2 \ 3', 4’
ađotrong DMSO-d6, 125 MHz, c500 MHz. ' ỗcủơ hợp chât toddaculin.
Trên phồ proton của hợp chất 2 quan sát thấy 5 tín hiệu proton olefin trong đó có 4 tín hiệu đặc trung cho 2 nối đôi nằm trong vòng ở độ chuyển dịch hóa học 7,85 (1H, d, J = 9,5 Hz), 6,57 (1H, d, J = 10,0 Hz), 6,20 (1H, d,
J = 9,5 Hz) và 5,71 (1H, d, J = 10,0 Hz); và 6,54 (1H, s). Ngoài ra còn quan sát thấy tín hiệu 1 nhóm methoxy tại 3,87 (3H, s) và 2 tín hiệu methyl bậc 4
Hình 4.8: Phổ 'H-NMR hợp chất 2
Trên phô cacbon và DEPT nhận biết được 15 tín hiệu cacbon với 7 tín hiệu cacbon bậc 4, 5 tín hiệu cacbon olefin, 2 tín hiệu cacbon của nhóm methyl và 1 tín hiệu cacbon của nhóm methoxy. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học kết hợp so sánh với số liệu phố của họp chất xanthoxyletin [32] thấy hoàn toàn phù hợp; cho phép dự đoán hợp chất 2 chính là xanthoxyletin.Sự sai khác tại một số vị trí được khang định lại dựa trên phố 2 chiều HSQC và HMBC.Các tín hiệu proton được gán với các tín hiệu cacbon tương ứng dựa trên việc phân tích phổ 2 chiều HSQC. Trên phổ 2 chiều HMBC quan sát thấy tương tác của proton nhóm methyl 1,47 (H-4) với các tín hiệu cacbon 77,47
160,98 (C-2). Tín hiệu proton nhóm methoxy với tín hiệu cacbon 152,79 (C- 5) cho phép khẳng định nhóm methoxy được gắn với cacbon C-5. Từ các kết quả phân tích trên có thể khắng định hợp chất 2 chính là xanthoxyletin có công thức phân tử C15H]4 0 4, M= 258
2 2 0 2 0 0 1 8 0 1 6 0 140 1 2 0 ÌOO 80 60 40 2 0 o
DEPT90 110 170 160 ISO 140 130 120 110 100 90 80 70 «0 so 40 30 20 ppa DEPT135 CHÍCH3 CH2 ---- ,--- Ỵ--- T--- r --- -r--- r- 110 170 ICO ISO 140 130 120 U I T " 100 C13CPD pf* iL —T...T...I...T...T...I...T...>...T— I N 170 ICO 150 140 130 120 110 100
Hình 4.10:Phô DEPT của họp chất 2
111.1 . 11 ... 11. o • . — • • * m • ♦ • — i * • • • — ♦ • * Hình 4.11:Phổ HMBC của hợp chất2 . . IJ, u ... 1 1 - — — —
Bảng 4.2SỐ liệu NMR của hợp chất 2 và các số liệu tham khảo
c *ÕC[1] ôcaJ DEPT ỏHa,D (irnilt., J = Hz) HMBC (H—>C)
2 160.9 160.98 c - 3 112.2 112.25 CH 6.20 (d, 9.5) 2, 4a 4 138.5 138.48 CH 7.85 (d, 9.5) 2, 5, 8a 4a 107.2 107.30 c - 5 152.7 152.79 c - 6 111.2 111.28 c - 7 157.4 157.51 c - 8 100.6 100.73 CH 6.54 (s) 4a, 6, 7, 8a 8a 155.4 155.51 c - 5- OMe 63.5 63.58 c h3 3.87 (s) 5 1' 115.7 115.74 CH 6.57 (d, 10.0) 5 ,7 ,3 ’ 2’ 130.5 130.53 CH 5.71 (d, 10.0) 6, 3’, 4’, 5’ 3’ 77.4 77.47 c - 4’ 28.2 28.06 c h3 1.47 (s) 2 \ 3’, 5’ 5’ 28.2 28.06 c h3 1.47 (s) 2’, 3', 4’
4.3. Xác định cấu trúc chất 3.
Phổ 1 chiều (proton, cacbon và DEPT) của hợp chất 3có dạng tương tự như hợp chất 2. Sự sai khác dễ nhận thấy nhất trên phổ của hợp chất 3 là sự chuyển dịch về phía trường mạnh của tín hiệu cacbon metin 91,29 (so với 100,73 của chất 2) và tín hiệu nhóm methoxy 55,75 (so với 63,58 của chất 2). Kết hợp so sánh với số liệu phổ của hợp chất alloxanthoxyletin [15], thấy hoàn toàn phù họp tại các vị trí tương ứng.Các tín hiệu proton được gán với các tín hiệu cacbon tương ứng dựa trên việc phân tích phố 2 chiều HSQC (bảng 3). Trên phổ 2 chiều HMBC quan sát thấy tương tác của 2 tín hiệu proton nhóm methyl 1,46 (H-4', H-5') với các tín hiệu cacbon 77,52 (C-3') và 127,32 (C-2'). Tương tác của proton olefin 5,55 (H-2') với các tín hiệu cacbon 77,52 (C-3') và 106,28 (C-6). Tương tác của proton 6,59 (H-l*) với các tín hiệu cacbon 77,53 (C-3'), 106,28 (C-6), 149,98 (C-5) và 158,05 (C-7); tương
Hình 4.14: Phổ 'H-NMR hơD chất 3
D E PT 90 180 170 160 ISO Ỉ4fl D E P T 1 3 5 CH i CH 3 130 120 110 100 90 80 70 60 SO 40 30 20 pọm CH 2 180 170 ICO ISO 14Q C 13C PD i l l 1 130 120 ỉ10 100 1 90 80 70 60 1 50 40 30 20 ppm 140 130
1 1 11 1 . 1 _ L - — - — — 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 Hình 4.18: Phổ HSQC của hợp chất 3
Bảng 4.3 Số liệu NMR của hợp chất 3 và các số liệu tham khảo
c ffÔC[l] ÔCÍMDEPT ôhíi,d (muit., / = Hz) HMBC (H—>C)
2 161.2 161.17 c - 3 111.0 110.91 CH 6.14 (d, 9.5) 2, 4a 4 138.4 138.34 CH 7.93 (d, 9.5) 2, 5, 8a 4a 102.4 103.47 c - 5 150.0 149.98 c - 6 106.3 106.28 c - 7 158.1 158.05 c - 8 91.3 91.29 CH 6.32 (s) 6, 7, 4a, 8a 8a 155.7 155.67 c - 7- OMe 55.8 55.75 c h3 3.86 (s) 7 1' 115.9 115.86 CH 6.59 (d, 10.0) 5, 6, 7, 3' 2’ 127.4 127.31 CH 5.55 (d, 10.0) 6, 3’, 4', 5’ c
K Ế T L U Ậ N
Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, ba hợp chất 5- demethyltoddaculin (1), xanthoxyletin (2) và alloxanthoxyletin (3) đã được phân lập từ lá cây Antidesma Acidum. c ấu tróc hóa học của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều.
T À I L IỆ U T H A M K H Ả O
[1] Võ Văn Chi, 1993. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Trẻ, tập 2.
[2] Phạm Thế Chính và cộng sự. Thành phần hóa học của lá chòi mòi tía
(.Antidesma bunius L.), Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Tập 90, 21-24
(2012).
[3] Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển 1, Nxb. Y Hà Nội.
[4] Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển 2, Nxb. Y Hà Nội.
[5] Adegoke s. A., Agada F. D., and Ogundipe L. o ., 2013. Antibacterial activity of methanol and ethanol leaf extracts of Antidesma venosum
and Lannea barteri.Afr. J. Microbiol. Res., 7(27): 3442-3447.
[6] Arbain D., and Taylor w . c ., 1993. Cyclopeptide alkaloids from
Antidesma m on tana. Phytochemistry, 33(5): 1263-1266.
[7] Bringmann G., Rischer H., Wohlfarth M., and Schlauer J., 2000. Biosynthesis of Antidesmone in Cell Cultures of Antidesma membranaceum (Euphorbiaceae): An Unprecedented Class of Glycine- Derived Alkaloids. J. Am. Chem. Soc., 122(41): 9905-9910.
[8] Buske A., Busemann s., Muhlbacher J., Schmidt J., Porzel A., Bringmann G., and Adam G., 1999. Antidesmone, a novel type isoquinoline alkaloid from Antidesma membranaceum
[10] Boyom F. F., Assembe E. z., A. Zollo P. H., Agnaniet H., Menut C., and Bessiere J. M., 2003. Aromatic plants of tropical central Africa. Part XLII. Volatile components from Antidesma laciniatum Muell. Arg. var. laciniatum growing in Cameroon. Flavour Fragrance /.,18(5): 451-453.
[11] Chen Y. C., Cheng M. J., Lee s . J., Dixit A. K., Ishikawa T., Tsai I. L., and Chen I. s., 2004. Coumarinolignans from the root of formosan
Antidesma pentandrum var. barbatum. Helv. Chim. Acta,87(11): 2805- 2811.
[12] Chen Y. C., Cheng M. J., Lee s . J., Tsai I. L., and Chen I. s., 2007. Chemical constituents from the root of Antidesma pentandrum var. barbatum. J. Chin. Chem. Soc. (Taipei, Taiwan), 54: 1325-1332.
[13] Djouossi M. G., Tebou p. L. F., Mabou F. D., Ngnokam D., Tapondjou L.A., Harakat D., and Nazabadioko L. V., 2014. Chevalierinoside A: A new isoflavonoid glycoside from the stem bark of Antidesma chevalieri
Beille (Euphorbiaceae). B u ll Chem. Soc. Ethiop., 28: 309-314.
[14] Elya B., Forestrania R. C., Ropi M., Kosela s., Awang K., Omar H., and Hadi A. H. A., 2014. The new alkaloid from Antidesma cuspidatum
M.A. Rec. Nat. Prod., 8(4):342-347.
[15] Eleni Melliou, Prokopios magiatis, Sofia Mitaku, Alexios- Leandros Skaltsounis, Efrosini Chinou, and Ioanna Chinou, Natural and synthetic 2,2- dimethylpyranocoumarins with antibacterial activity, J. N. p, 2005,
[17] Gargantiel M. F., and Ysrael M. C., 2014. Antioxidant activity andhypoglycemic potential of Antidesma ghasembilla Gaertn (Phyllantaceae). International J. Sci. Tec. Resreach., 3(3): 422-431. [18] Hashendra S. Kathriarachchi, Petra Hoffmann, Rosabelle Samuel,
Kenneth J. Wurdack, and Mark W. Chase (2005). “Molecular phylogenetics of Phyllanthaceae inferred from five genes (plastid atpB, matK, 3'ndhF, rbcL, and nuclear PHYC)”. Molecular Phylogenetics and Evolution 36 (1): 112-134. doi:10.1016/j.ympev.2004.12.002. [19] J. O. Kokwaro, I. Messana, C. Galeffi, M. Patamia and G. B. M.
Bettolo.,1983. Research on African Medicinal Plants V.l Coumarins from Zanthoxylum usambarense. Planta medica, Vol 47, 251-253. [20] Kenneth J. Wurdack, Charles C. Davis. 2009. "Malpighiales
phylogenetics: Gaining ground on one of the most recalcitrant clades in the angiosperm tree of life." American Journal of Botany 96(8): 1551 -
1570
[21] Kikuchi H., Tensho A., Shimizu I., Shiokawa H., Kuno A., Yamada S.,Fujiwara T., and Tomita K., 1983. Lupeolactone, a new |3-lactone from Antidesma pentandnim Merr. Chem. Lett.,4: 603-606.
[22] Mahomoodally M. F., Fakim A. G., and Subratty A. H., 2006. Stimulatoryeffects of Antidesma madagascariense on D-glucose, L- tyrosine, fluid and electrolyte transport across rat everted intestine, comparable to insulin action in vitro. Br JBiom ed Sci,63(1): 12-17. [23] Magadula J. J., Mulholland D. A., and Crouch N. R., 2012. The
[24] Maria S., Islam F., Qais N., and Hasan C. M., 2-13. Isolation of vomifoliol: a megastigmane from leaves of Antidesma ghaesembilla. Asian J. Chem.,25(6): 3533-3534.
[25] Mwangomo D. T., Moshi M. J., and Magadula J. J., 2012. Antimicrobialactivity and phytochemical screening of Antidesma venosum root and stem bark ethanolic extracts. Int. J. Res. Phytochem. Pharma col., 2(2): 90-95.
[26] Nuengchamnong N., and Ingkaninan K., 2009. On-line HPLC-MS- DPPH assay for the analysis of phenolic antioxidant compounds in fruit wine: Antidesma thwaitesianum Muell. Food Chem., 118(1): 147-152. [27] Petra Hoffman. 2007. "Phyllanthaceae" tr. 250-252. Trong: Vernon H.
Hey wood, Richard K. Brummitt, Ole Seberg, Alastair Culham. Flowering Plant Families of the World. Firefly Books: Ontario, Canada.
[28] Puangpronpitag D., Areejitranusorn P., Boonsiri P., Suttajit M., andYongvanit P., 2008. Antioxidant activities of polyphenolic compounds isolated from Antidesma thwaitesianum Müll. Arg. seeds and marcs. JF ood Sei., 73(9):C648-53.
[29] Rosabelle Samuel, Hashendra S. Kathriarachchi, Petra Hoffmann, Michael H.J. Barfuss, Kenneth J. Wurdack, Charles C. Davis, and Mark W. Chase. 2005. "Molecular phylogenetics of Phyllanthaceae: evidence from plastid matK and nuclear PHYC sequences." American Journal of Botany 92(1): 132-141.