II. Phân lập và tuyển chọn chủng Azospirillum tổng hợp Auxin và Giberelin
1. Phân lập chủng Azotobacter spp từ đất
a. Lấy mẫu
Mẫu đất được thu thập từ bảy địa điểm khác nhau, như sau: 1. đất trồng cây họ đậu 2. đất trồng cây thực vật 3. đất trồng lúa 4. đất trồng cỏ 5. đất lâm nghiệp 6. Đất chưa sử dụng 7. Nước sông trầm tích.
Lấy mẫu đất được thu thập từ bảy địa điểm khác nhau,mẫu đất thu thập một số nhựa túi xách, bút đánh dấu, thìa, rượu và dao đã được thực hiện. Lúc đầu người ta chọn một khu vực để lấy mẫu, sau đó họ lựa chọn bốn hoặc năm điểm trong khu vực đó và thu thập đất và trộn bốn hay năm điểm mẫu đất với nhau. Đủ lượng đất được thu thập từ mỗi trang web, giữ trong một túi nilon và được gắn thẻ. Mẫu đất được thu thập từ trên 4 cm đất, vì đây là nơi mà hầu hết các hoạt động của vi sinh vật diễn ra, và do đó nơi mà hầu hết vi khuẩn tập trung.
SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 36
b. Xác định độ ẩm
50 mẫu gm được cân bằn một cốc thủy tinh 150ml sạch, trọng lượng của cốc thủy tinh đã được cân trước khi đổmẫu đất. Sau đó nó được lưu giữ trong hơn 105 º C ± 3 º C trong 24 giờ, và sau đó một lần nữa trọng lượng của mẫu đất và cốc thủy tinh đã được đưa combinedly. Sự khác biệt về độ ẩm của đất đã được ghi lại và được tính trên độ ẩm của mẫu.
c. Xác định PH của mẫu
25 gm (lĩnh vực ẩm) đã được cân trong một cốc thủy tinh sạch và khô ml 150 và 50 ml nước cất đã được bổ sung. Khuấy bằng máy votex. pH của mẫu được đo bằng máy đo PH
d. Chuẩn bị môi trường phân lập
Người ta chuẩn bị mơ trường cho một lít như sau:
Theo phương tiện truyền thông thành phần, các thuốc thử được cân bằng cân bằng điện tử
- 1000 ml nước cất đã được đo bằng bình định mức và thực hiện trong một bình nón.
- Các thuốc thử (trừ agar) được trộn với nước cất.
- Sau khi trộn thuốc thử, pH được điều chỉnh bằng cách thêm HCl hoặc dung dịch NaOH nếu có cần thiết.
- Sau khi điều chỉnh pH, agar được trộn vào dung dịch. - Sau khi trộn thạch, môi trường được đem di hấp khử trùng - Cuối cùng môi trường được đổ trong hộp Petri vô trùng.
SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 37
e. Phân lập
10 gm mẫu thu thập được thêm vào 90 ml nước cất vô trùng trong một bình nón vô trùng (250 ml), lắc kĩ bằng máy votex sau đó để yên trong 30 phút. 1 ml dung dịch mẫu sau đó được chuyển sang ống nghiệm chứa 9
ml nước cất và lắc bằng tay và một lần nữa để yên trong 30 phút. Tiếp tục pha loãng đến 105. Một ml mẫu (từ 101 đến 105 phần nhỏ) được rót trong một tấm Petri vô trùng có chứa khoảng 15 ml môi trưpwngf sau khi hấp khử trùng (45 º C),môi trường Ashby, và sau đó ủ ở nhiệt độ 28 ± 2 º C trong khoảng 2 - 3 ngày. Sau khi ủ,các khuẩn lac lạc xuất hiện trên môi trường . Sau đó người ta tính toán số lượng Azotobacter mỗi gram đất
f. Nghiên cứu khả năng phát triển của chủng trong một số môi trường
Người ta tiến hành nghiên cứu trên mơi trường có nồng độ muối khác nhau thay đổi từ 0-1% sau đó ủ trong vòng 48h ở nhiệt độ 28o
C.
Người ta cũng tiến hành nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của chủng trong điều kiện nhiệt độ thay đổi từ 10oC-50oC để dánh giá khả năng chịu nhiệt của chủng từ đó lựa chọn ra chủng tối ưu phục vụ cho việc sử dụng trong sản xuất phân sau này
g. Kết quả
Dựa vào bảng kết quả trên ta thấy rằng những chủng được lấy từ vùng đất trồng đậu tương có mật độ tế bào nhiều nhất
Từ bảng số liệu trên ta thấy rằng không có chủng ở mẫu nào sống sót được ở nồng độ NaCl 1,0%. Các chủng ở các mẫu 1,2,3,4,5 và 6 cho thấy sự tăng trưởng tối đa ở 0% NaCl trong khi các mẫu 1,3,4 đã cho thấy sự tăng trưởng cả ở mức 0% và 0,2% nhưng không như
SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 38 nhau,các mẫu 1 và 4 tăng trưởng 0,4% và 0,6% nồng độ NaCl.. 1 và 4 cũng tăng nồng độ NaCl 0,8%. Từ đây có thể thấy rằng các mẫu 1 và 4 có thể được dùng để sản xuất phân bón
ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng
Ta thấy rằng Tất cả các mẫu phân lập đều tăng trưởng tối đa ở 30 º C. các mẫu 1, 3 và 4 cho thấy tốc độ tăng trưởng tối đa ở 30 º C và 40 º C. Không có mẫu phân lập nào sống sót ở 50 º C. mẫu 4 cho thấy tốc độ tăng trưởng ở mức 10 º C. từ đó ta thấy rằng nhiệt độ ủ của mẫu nên là 30oC
Kết luận
nghiên cứu cho thấy rằng mẫu đất được lấy từ những vùng trồng đậu tương là phù hợp nhất với điều kiên canh tac cua cây trồng và nó có thể được dùng để sản xuất phân bón vi sinh giảm giá thành sản phẩm
SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN 1 (SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà)
1. http://en.wikipedia.org/wiki/Azotobacter
2. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN AZOTOBACTER CÓ HOẠT TÍNH NITROGENAZA VÀ SINH TỔNG HỢP IAA, Đỗ Thu Hà, ĐH Đà Nẵng, 2008
3. Evidence for a Non- trytophan dependent pathway, E. Prinsen et al,1993.
5. Antifungal and Phytohormone Production Potential of Azotobacter chroococum Isolates from Groundnut Rhizophere, 2009.
6. Biosynthesis of cytokinins, Tatsuo Kakimoto, 2003.
PHẦN 2 (SVTH: Đặng Thị Thuý) [1]http://publication.ctu.edu.vn/en/index.php/tapchi/doc_details/1371-phan-lp-va-tuyn- chn-cac-chng-vi-khun-pseudomonas-co-kh-nng-hoa-tan-lan-va-sinh-tng-hp-auxin-cao [2]http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=12&cad=rja &ved=0CCoQFjABOAo&url=http%3A%2F%2Fjournals.tubitak.gov.tr%2Fbiology%2Fissue s%2Fbiy-08-32-1%2Fbiy-32-1-2-0703- 5.pdf&ei=IHuoULHRPIijiAfdjYGoCg&usg=AFQjCNGBU8AVhSniRQ1Ei3AoehXxm6mT WA&sig2=lYxclDRKbnAJY_c_Brq8Yg [4]http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=7&cad=rja &ved=0CFoQFjAG&url=http%3A%2F%2Fjournals.tubitak.gov.tr%2Fbiology%2Fissues%2 Fbiy-05-29-1%2Fbiy-29-1-5-0410- 1.pdf&ei=xlWoUOSpAoqhiAe8_IDoCw&usg=AFQjCNGdepVDJ- zpSRulhrOxdh5AMWDGiA&sig2=q9VLw4FUjswdvndc3qjO9g [5]http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja &ved=0CB4QFjAA&url=http%3A%2F%2Fpublication.ctu.edu.vn%2Findex.php%2Ftapchi %2Fdoc_download%2F1467-kho-sat-kh-nng-sinh-tng-hp-iaa-va-c-nh-m-ca-vi-khun- gluconacetobacter-sp-va-azospirillum-sp-c-phan-lp-t-cay-mia&ei=zqiSUMPCC- iViAfM9oGQBQ&usg=AFQjCNFbCgUrd0Y4p-CjO3T116TEuJBxtA&sig2=E- xjIv6xqGLSM08YIiVt-g [6]http://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja &sqi=2&ved=0CCMQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.pelagiaresearchlibrary.com%2Fder -chemica-sinica%2Fvol1-iss3%2FDCS-2010-1-3-138-145.pdf&ei=kd-oUP- BJYyjigf1pYHQDg&usg=AFQjCNG_LO9nIBar_G3_dc_7GFd- 6VnEDw&sig2=jrMZ0GUl35lqs0GLlqQuMg PHẦN 3 (SVTH: Nguyễn Văn Hùng)