cerevisiae của dịch ép trích trái nhàu sống theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy (ký hiệu: F)
Mục đích: khảo sát khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ép trích trái nhàu sống (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng
cùng với môi trƣờng nuôi cấy để xác định khả năng kháng nấm men của dịch ép trích trái nhàu sống để so sánh, đối chiếu với các thí nghiệm sau.
Phƣơng pháp thực hiện
Lần 1: chuẩn bị 10 đĩa petri và 62 ml dịch trích trái nhàu sống, dịch nấm men 0,100g/40ml nƣớc muối sinh lý 0,85%
Ký hiệu (F 1: 1) (1 dịch trích trái nhàu (10ml) /1 môi trƣờng (10ml)) sử dụng ống đong để đong 30ml dịch ngâm trích trái nhàu sống và 30ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (F 1: 3) (1 dịch trích trái nhàu (7 ml) / 3 môi trƣờng (13 ml)) sử dụng ống đong để đong 21 ml dịch ngâm trích trái nhàu sống và 39 ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (F 1: 6) (1 dịch trích trái nhàu (3,5ml) / 6 môi trƣờng (16,5 ml)) sử dụng ống đong để đong 10,5 ml dịch ngâm trích trái nhàu sống và 49,5 ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự
Ký hiệu (F Đối chứng) đỗ đĩa đối chứng 20ml môi trƣờng, để môi trƣờng thạch nguội tự nhiên và dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên. Đem tất cả các đĩa vô tủ ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 48h thi lấy ra quan sát và nhận xét khả năng kháng nấm men.
Mọi thao tác đều đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN *****
4.1. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
4.1.1. Khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu chín (trái nhàu: nƣớc là 1: 1)trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy và tiệt trùng ở 121 0C trong 15 phút (ký hiệu: A)
Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm men của dịch ngâm trích trái nhàu chín đã đƣợc tiệt trùng ở 1210
C theo các tỷ lệ pha loãng với môi trƣờng nuôi cấy có sự kháng nấm nem. Tuy nhiên khả năng kháng nấm men thay đổi theo tỷ lệ pha loãng với môi trƣờng nuôi cấy.
Mẫu 1: 1 (1 dịch trích trái nhàu (10ml) / 1 môi trƣờng (10ml)): có khả năng kháng nấm men tốt nhất với 3 lần thí nghiệm lập lại, số khuẩn lạc ít nhất là 0 và nhiều nhất là 2/đĩa.
Mẫu 1: 3 (1 dịch trích trái nhàu (7 ml) / 3 môi trƣờng (13 ml)): có khả năng kháng nấm men tốt với 3 lần thí nghiệm lập lại, số khuẩn lạc đều là 2/đĩa.
Mẫu 1: 6 (1 dịch trích trái nhàu (3,5ml) / 6 môi trƣờng (16,5 ml)): có khả năng kháng nấm men không tốt bằng tỷ lệ 1/3. Với 3 lần thí nghiệm lập lại, số khuẩn lạc ít nhất là 10 nhiều nhất là hơn 20 khuẩn lạc/đĩa.
Mẫu đối chứng: nấm men phát triển khắp bề mặt thạch
Bảng 4.1: Khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu chín (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy và tiệt trùng ở 121 0C trong 15 phút
stt Số lần thí nghiệm Bố trí thí nghiệm Kết quả thí nghiệm
1 Lần 1
Mẫu A đối chứng Nấm men phát triển toàn bề mặt đĩa Mẫu A 1: 1 Có 1 khuẩn lạc nhỏ
Mẫu A 1: 3 Có nhiều hơn 2 khuẩn lạc Mẫu A 1: 6 Có nhiều hơn 10 khuẩn lạc
2 Lần 2
Mẫu A đối chứng Nấm men phát triển toàn bề mặt đĩa Mẫu A 1: 1 Có 2 khuẩn lạc nhỏ
Mẫu A 1: 3 Có 2 khuẩn lạc nhỏ
Mẫu A 1: 6 Có nhiều hơn 20 khuẩn lạc
Mẫu A đối chứng Nấm men phát triển toàn bề mặt đĩa Mẫu A 1: 1 Không có khuẩn lạc
4.1.2.Khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu sống trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy trái nhàu sống trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy và tiệt trùng ở 121 0C trong 15 phút (ký hiệu: B)
Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm men của dịch ngâm trích trái nhàu sống đã đƣợc tiệt trùng ở 1210
C theo các tỷ lệ pha loãng với môi trƣờng nuôi cấy có khả năng kháng nấm nem tƣơng tự dịch ngâm trích trái nhàu chín đã tiệt trùng ở 1210
C theo các tỷ lệ pha loãng với môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên khả năng kháng nấm men của dịch ngâm trích trái nhàu sống đã đƣợc tiệt trùng ở 1210
C yếu hơn và thay đổi theo tỷ lệ pha loãng với môi trƣờng nuôi cấy.
Mẫu A 1: 1 (1 dịch trích trái nhàu (10ml) / 1 môi trƣờng (10ml)): có khả năng kháng nấm men tốt nhất với 3 lần thí nghiệm lập lại, số khuẩn lạc từ 0 – 2/đĩa. Mẫu A 1: 3 (1 dịch trích trái nhàu (7 ml) / 3 môi trƣờng (13 ml)): có khả năng kháng nấm men tốt với 3 lần thí nghiệm lập lại, số khuẩn lạc đều hơn 10/đĩa.
Mẫu A 1: 6 (1 dịch trích trái nhàu (3,5ml) / 6 môi trƣờng (16,5 ml)): có khả năng kháng nấm men không tốt bằng mẫu (A 1: 3) . Với 3 lần thí nghiệm lập lại, số khuẩn lạc đều hơn 20/đĩa.
Mẫu đối chứng: nấm men phát triển khắp bề mặt thạch
Bảng 4.2: Khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu sống trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy và tiệt trùng ở 121 0
C trong 15 phút
stt Số lần thí
nghiệm Bố trí thí nghiệm Kết quả thí nghiệm
1 Lần 1
Mẫu B đối chứng Nấm men phát triển toàn bề mặt đĩa Mẫu B 1: 1 Không có khuẩn lạc
Mẫu B 1: 3 Có nhiều hơn 10 khuẩn lạc nhỏ Mẫu B 1: 6 Có nhiều hơn 20 khuẩn lạc nhỏ
2 Lần 2
Mẫu B đối chứng Nấm men phát triển toàn bề mặt đĩa Mẫu B 1: 1 Có nhiều hơn 2 khuẩn lạc nhỏ Mẫu B 1: 3 Có nhiều hơn 10 khuẩn lạc nhỏ Mẫu B 1: 6 Có nhiều hơn 20 khuẩn lạc nhỏ
3 Lần 3
Mẫu B đối chứng Nấm men phát triển toàn bề mặt đĩa Mẫu B 1: 1 Có nhiều hơn 2 khuẩn lạc nhỏ Mẫu B 1: 3 Có nhiều hơn 10 khuẩn lạc nhỏ Mẫu B 1: 6 Có nhiều hơn 20 khuẩn lạc nhỏ
Hình kết quả thí nghiệm 2 (Hình 2, phụ lục I)
4.1.3. Khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu sống trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy trái nhàu sống trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy (ký hiệu: M)
Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm men của dịch ngâm trích trái nhàu sống trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng với môi trƣờng nuôi cấy có khả năng kháng nấm nem tƣơng tự dịch ngâm trích trái nhàu chín và dịch ngâm trích trái nhàu sống đã tiệt trùng ở 1210
C theo các tỷ lệ pha loãng với môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên khả năng kháng nấm men của dịch ngâm trích trái nhàu sống yếu hơn dịch ngâm trích trái nhàu chín và dịch ngâm trích trái nhàu sống đã tiệt trùng ở 1210
C và thay đổi theo tỷ lệ pha loãng với môi trƣờng nuôi cấy.
Mẫu B 1: 1 (1 dịch trích trái nhàu (10ml) / 1 môi trƣờng (10ml)): có khả năng kháng nấm men tốt nhất với 3 lần thí nghiệm lập lại, không có khuẩn lạc/đĩa.
Mẫu B 1: 3 (1 dịch trích trái nhàu (7 ml) / 3 môi trƣờng (13 ml)): có khả năng kháng nấm men tốt với 3 lần thí nghiệm lập lại, số khuẩn lạc ít nhất là hơn 10 nhiều nhất là hơn 30/đĩa.
Mẫu B1: 6 (1 dịch trích trái nhàu (3,5ml) / 6 môi trƣờng (16,5 ml)): có khả năng kháng nấm men không tốt bằng mẫu (B 1: 3). Với 3 lần thí nghiệm lập lại, số khuẩn lạc ít nhất là hơn 30 nhiều nhất là hơn 40/đĩa.
Mẫu đối chứng: nấm men phát triển khắp bề mặt thạch
Bảng 4.3: Khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu sống trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy
stt Số lần thí
nghiệm Bố trí thí nghiệm Kết quả thí nghiệm
1 Lần 1
Mẫu M đối chứng Nấm men phát triển toàn bề mặt đĩa Mẫu M 1: 1 Không có khuẩn lạc
Mẫu M 1: 3 Có nhiều hơn 30 khuẩn lạc nhỏ Mẫu M 1: 6 Có nhiều hơn 40 khuẩn lạc nhỏ
2 Lần 2
Mẫu M đối chứng Nấm men phát triển toàn bề mặt đĩa Mẫu M 1: 1 Không có khuẩn lạc
Mẫu M 1: 3 Có nhiều hơn 10 khuẩn lạc nhỏ Mẫu M 1: 6 Có nhiều hơn 40 khuẩn lạc nhỏ
3 Lần 3
Mẫu M đối chứng Nấm men phát triển toàn bề mặt đĩa Mẫu M 1: 1 Không có khuẩn lạc
Mẫu M 1: 3 Có nhiều hơn 10 khuẩn lạc nhỏ Mẫu M 1: 6 Có nhiều hơn 30 khuẩn lạc nhỏ
theo các tỷ lệ pha loãng với môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên khả năng kháng nấm men của dịch ép trích trái nhàu sống yếu hơn dịch ngâm trích trái nhàu chín và dịch ngâm trích trái nhàu sống đã tiệt trùng ở 1210
C và thay đổi theo tỷ lệ pha loãng với môi trƣờng nuôi cấy.
Mẫu M 1: 1 (1 dịch trích trái nhàu (10ml) / 1 môi trƣờng (10ml)): có khả năng kháng nấm men tốt nhất với 3 lần thí nghiệm lập lại, không có khuẩn lạc/đĩa.
Mẫu M 1: 3 (1 dịch trích trái nhàu (7 ml) / 3 môi trƣờng (13 ml)): có khả năng kháng nấm men tốt với 3 lần thí nghiệm lập lại, số khuẩn lạc ít nhất là 2 và nhiều nhất là 10/đĩa.
Mẫu M 1: 6 (1 dịch trích trái nhàu (3,5ml) / 6 môi trƣờng (16,5 ml)): có khả năng kháng nấm men không tốt bằng tỷ lệ 1/3. Với 3 lần thí nghiệm lập lại, số khuẩn lạc đều hơn 20/đĩa.
Mẫu đối chứng: nấm men phát triển khắp bề mặt thạch
Bảng 4.4: Khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ép trích trái nhàu sống theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy
stt Số lần thí nghiệm
Bố trí thí
nghiệm Kết quả thí nghiệm
1 Lần 1
Mẫu F đối chứng Nấm men phát triển tốt Mẫu F 1: 1 Không có khuẩn lạc
Mẫu F 1: 3 Có nhiều hơn 2 khuẩn lạc nhỏ Mẫu F 1: 6 Có nhiều hơn 20 khuẩn lạc nhỏ
2 Lần 2
Mẫu F đối chứng Nấm men phát triển tốt Mẫu F 1: 1 Không có khuẩn lạc
Mẫu F 1: 3 Có nhiều hơn 10 khuẩn lạc nhỏ Mẫu F 1: 6 Có nhiều hơn 20 khuẩn lạc nhỏ
3 Lần 3
Mẫu F đối chứng Nấm men phát triển tốt Mẫu F 1: 1 Không có khuẩn lạc
Mẫu F 1: 3 Có nhiều hơn 10 khuẩn lạc nhỏ Mẫu F 1: 6 Có nhiều hơn 20 khuẩn lạc nhỏ
Hình kết quả thí nghiệm 4 (Hình 4, phụ lục II)
4.2. THẢO LUẬN
Qua 4 thí nghiệm khảo sát về khả năng kháng nấm men của dịch trái nhàu với các phƣơng pháp ép trích khác nhau, có tiệt trùng và không tiệt trùng, nguyên liệu sống và nguyên liệu chín đều có tác dụng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae, khả năng kháng nấm men có sự khác biệt giữa các tỷ lệ pha loãng với môi trƣờng nuôi cấy.
Kết quả nghiên cứu này phù hợp với một số kết quả nghiên cứu khác có liên quan đến tác dụng kháng sinh của trái nhàu:
Theo kết quả của một số nghiên cứu khác, noni ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn, chẳng hạn nhƣ Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus morgaii, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Helicobacter pylori, vi khuẩn Salmonella và Shigella (Atkinson, 1956). Tác giả cũng công bố rằng tác dụng chống vi khuẩn có thể là do các sự hiện diện của các hợp chất phenolic nhƣ acubin, L- asperuloside, scopoletin và anthraquinones khác.
Theo một nghiên cứu khác về hoạt động kháng khuẩn của 2 nhóm: (1) vi khuẩn:
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Sarcina thể vàng, Staphilococcus aureus, (2) nấm: Aspergillus niger, Candida albicans,
Saccharomyces sake đƣợc xác định bằng cách xét nghiệm khuếch tán đĩa và ủ trong 24 giờ ở 42-44 0
C, sau đó tiến hành đo đƣờng kính vùng ức chế. Kết quả đƣờng kính kháng khuẩn là: Bacillus subtilis 14,0 mm, Escherichia coli 12,5 mm, Micrococcus luteus 13,0 mm , Sarcina 6,8 mm, Candida albicans 7,5 mm, Saccharomyces sake 6,3 mm (W. Xiang et al, 2008).
Dịch nhàu có khả năng kháng nấm men là do trong dịch nhàu có hoạt tính sinh học của Iridoids, các tác dụng sinh học của cây Nhàu và quả nhàu chủ yếu là do Iridoids quyết định, có 16 loại Iridoids. (Roso, 2008).
Tác dụng kháng sinh: Isoplumericin, Plumericin, Galioside, Gardenoside, Gentiopicroside có tác dụng kháng với nhiều loại vi khuẩn nhƣ tụ cầu trùng vàng,
E.coli, Bacillus .... . Các Acibin, Aleuropein, Arbortristoside A và C và Lucidumoside có tác dụng ức chế các virus hô hấp. Các Plumericin, Isoplumericin, Epoxygaertnroside, Methoxy - Gaertnroside có tác dụng ức chế các ký sinh trùng amip, ký sinh trùng sốt rét (Roso, 2008 ).
CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
*****
5.1. KẾT LUẬN
Sau khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm men của dịch ép trích trái nhàu với các tỉ lệ pha loãng của dịch nhàu có tiệt trùng và không có tiệt trùng, giữa dịch ép trích và ngâm trích, giữa trái nhàu sống và trái nhàu chín, có thể rút ra đƣợc các kết luận sau:
Tỷ lệ 1/1 (1 dịch trích trái nhàu (10ml) / 1 môi trƣờng (10ml)) khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu sống trong 24h và dịch ép trích trái nhàu sống là có hiệu quả kháng nấm men tốt nhất (không có khuẩn lạc/đĩa). Khả năng kháng nấm men của dịch ngâm trích trái nhàu sống trong 24h và dịch ngâm trích trái nhàu chín trong 24h đƣợc tiệt trùng ở 121 0
C trong 15 phút cũng đạt đƣợc hiệu quả kháng nấm men tốt. Kết quả này cho thấy hoạt chất sinh học có trong trái nhàu rất bền nhiệt và khả năng kháng nấm men không thay đổi.
Tỷ lệ 1/3 (1 dịch trích trái nhàu (7 ml) / 3 môi trƣờng (13 ml)) khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ép trích trái nhàu sống, dịch ngâm trích trái nhàu sống trong 24h đƣợc tiệt trùng ở 121 0C trong 15 phút và dịch ngâm trích trái nhàu chín trong 24h đƣợc tiệt trùng ở 121 0C trong 15 phút đều có hiệu quả kháng nấm men tốt, số khuẩn lạc dao động từ 2 – 10/đĩa. Dịch ngâm trích trái nhàu sống trong 24h có hiệu quả kháng nấm men yếu hơn số khuẩn lạc dao động từ 10 – 30/đĩa.
Tỷ lệ 1/6 (1 dịch trích trái nhàu (3,5ml) / 6 môi trƣờng (16,5 ml)) khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ép trích trái nhàu sống, dịch ngâm trích trái nhàu sống trong 24h đƣợc tiệt trùng ở 121 0C trong 15 phút và dịch ngâm trích trái nhàu chín trong 24h đƣợc tiệt trùng ở 121 0C trong 15 phút đều có hiệu quả kháng nấm men tốt, số khuẩn lạc dao động từ 10 – 20/đĩa. Dịch ngâm trích trái nhàu sống trong 24h có hiệu quả kháng nấm men yếu hơn số khuẩn lạc dao động từ 30 – 40/đĩa.
5.2. ĐỀ NGHỊ
Vì thời gian có hạn và trang thiết bị còn hạn chế nên chƣa thể tiến hành tiến hành