3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện từ ngày 03/01/2013 đến ngày 5 /05/2013
Địa điểm: tiến hành thí nghiệm tại phòng D106 thuộc Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng – Trƣờng Đại Học Cần Thơ. 3.1.2. Hóa chất sử dụng
Thạch agar (loại thƣợng hạng đƣợc mua tại cửa hàng hóa chất Niềm Nam) Nƣớc cất
Nƣớc muối sinh lý 0,85%
3.1.3. Nguyên liệu và môi trƣờng nuôi cấy
Trái nhàu đƣợc trồng tại Huyện Phong Điền - TP Cần Thơ Nấm men S.cerevisiae loại làm bánh mì, dạng khô.
Môi trƣờng thạch khoai tây
3.1.4. Dụng cụ, thiết bị
Buồng cấy vô trùng, tủ ủ Cân kỹ thuật Que trang Đèn cồn, bếp điện, bếp gas Pipét Brix kế pH kế
Bình tam giác loại 250 ml
Đĩa Petri và một số dụng cụ khác cần dùng trong phòng thí nghiệm.
3.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1. Ép trích ly dịch triết trái nhàu 3.2.1. Ép trích ly dịch triết trái nhàu
Tiến hành nghiền khô và ép trích ly dịch trái nhàu sau đó tiến hành lọc bằng giấy lọc. Sau khi lọc xong, tiến hành đo pH và Brix, đậy lại bằng giấy bạc và bảo quản trong tủ mát.
Tiến hành nghiền nƣớc với tỉ lệ 1: 1 và ngâm trích trong 24h sau đó mới ép trích, rồi tiến hành lọc qua giấy lọc, kiểm tra pH và oBrix, đậy lại bằng giấy bạc và bảo quản ở tủ mát.
pH của dịch nhàu dao động không lớn 3,9 – 4,5
oBrix của dịch nhàu không cao 2- 3 (dịch ngâm trích), 5 – 6 (ép trích).
3.2.2. Pha chế môi trƣờng thạch khoai tây
*Công thức: Khoai tây: 200 gr. Đƣờng dextrose: 20 gr. Thạch agar: 16 gr. Nƣớc: 1000 ml *Cách pha:
Khoai tây rửa sạch và cắt thành hình khối 1 cm, sau đó chọn và rửa sạch chai lọ để dùng.
Cho khoai vào nồi, thêm nƣớc vừa đủ một lít, đun sôi khoảng 15 đến 20 phút, gạn lấy dịch trong (nƣớc chiết khoai tây), thêm nƣớc đến 1 lít. Thêm đƣờng, agar - khuấy đều tay và đun nhỏ lửa cho tan hết agar.
Khử trùng ở 121 oC trong 15 phút, sau đó để nguội lại ở nhiệt độ phòng và tiến hành đỗ đĩa petri. Nếu sau một thời gian thấy các nốt, hoặc đốm trên bề mặt thạch là môi trƣờng chƣa hoàn toàn đƣợc tiệt trùng.
3.2.3. Pha chế dung dịch nấm nem
Nấm nem Saccharomyces cerevisiae đƣợc cho vào 40ml/0,100g dung dịch muối sinh lý, lắc nhẹ và đậy nút bông lại.
3.3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆN
3.3.1. Thí nghiệm 1: khảo sát khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu chín (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu chín (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy và tiệt trùng ở 121
0C trong 15 phút (ký hiệu: A )
Mục đích: khảo sát khả năng kháng nấm men của dịch ngâm trích trái nhàu chín (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy và tiệt trùng ở 121 0C trong 15 phút để xác định khả năng chịu nhiệt và
kháng nấm men của dịch ngâm trích trái nhàu chín để so sánh, đối chiếu với các thí nghiệm sau.
Phƣơng pháp thực hiện
Lần 1: chuẩn bị 10 đĩa petri và 62 ml dịch trích trái nhàu chín, dịch nấm men 0,100g/40ml nƣớc muối sinh lý 0,85% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ký hiệu (A 1: 1) (1 dịch trích trái nhàu (10ml) / 1 môi trƣờng (10ml)) sử dụng ống đong để đong 30 ml dịch ngâm trích trái nhàu và 30 ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đong lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (A 1: 3) (1 dịch trích trái nhàu (7ml) / 3 môi trƣờng (13ml)) sử dụng ống đong để đong 21 ml dịch ngâm trích trái nhàu và 39 ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (A 1: 6) (1 dịch trích trái nhàu (3,5ml) / 6 môi trƣờng (16,5ml)) sử dụng ống đong để đong 10,5 ml dịch ngâm trích trái nhàu và 49,5 ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự
vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Đem tất cả các đĩa vô tủ ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 48h thi lấy ra quan sát và nhận xét khả năng kháng nấm men.
Mọi thao tác đều đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 3 lần lặp lại và kết quả đƣợc lấy ở giá trị trung bình.
3.3.2. Thí nghiệm 2: khảo sát khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu sống (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu sống (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy và tiệt trùng ở 121
0C trong 15 phút (ký hiệu: B)
Mục đích: khảo sát khả năng kháng nấm men của dịch ngâm trích trái nhàu sống (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy và tiệt trùng ở 121 0C trong 15 phút để xác định khả năng chịu nhiệt và kháng nấm men của dịch ngâm trích trái nhàu sống để so sánh, đối chiếu với các thí nghiệm sau.
Phƣơng pháp thực hiện
Lần 1: chuẩn bị 10 đĩa petri và 62 ml dịch trích trái nhàu sống, dịch nấm men 0,100g/40ml nƣớc muối sinh lý 0,85%
Ký hiệu (B 1: 1) (1 dịch trích trái nhàu (10ml) / 1 môi trƣờng (10ml)) sử dụng ống đong để đong 30 ml dịch ngâm trích trái nhàu sống và 30ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (B 1: 3) (1 dịch trích trái nhàu (7ml) / 3 môi trƣờng (13ml)) sử dụng ống đong để đong 21 ml dịch ngâm trích trái nhàu sống và 39 ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250 ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút
0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (B 1: 6) (1 dịch trích trái nhàu (3,5ml) / 6 môi trƣờng (16,5ml)) sử dụng ống đong để đong 10,5 ml dịch ngâm trích trái nhàu sống và 49,5 ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (B Đối chứng) sử dụng 20ml môi trƣờng đã tiệt trùng đỗ đĩa để đối chứng, để môi trƣờng thạch nguội tự nhiên và dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Đem tất cả các đĩa vô tủ ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 48h thi lấy ra quan sát và nhận xét khả năng kháng nấm men.
Mọi thao tác đều đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 3 lần lặp lại và kết quả đƣợc lấy ở giá trị trung bình.
3.3.3. Thí nghiệm 3: khảo sát khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu sống (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu sống (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy (ký hiệu: M)
Mục đích: khảo sát khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ngâm trích trái nhàu sống (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy để xác định khả năng kháng nấm men của dịch ngâm trích trái nhàu sống để so sánh, đối chiếu với các thí nghiệm sau.
Phƣơng pháp thực hiện
Lần 1: chuẩn bị 10 đĩa petri và 62 ml dịch trích trái nhàu sống, dịch nấm men 0,100g/40ml nƣớc muối sinh lý 0,85% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đong lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (M 1: 3) (1 dịch trích trái nhàu (7ml) / 3 môi trƣờng (13ml)) sử dụng ống đong để đong 21 ml dịch ngâm trích trái nhàu sống và 39 ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (M 1: 6) (1 dịch trích trái nhàu (3,5 ml) / 6 môi trƣờng (16,5 ml)) sử dụng ống đong để đong 10,5 ml dịch ngâm trích trái nhàu sống và 49,5 ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (M Đối chứng) sử dụng 20 ml môi trƣờng đã tiệt trùng đỗ đĩa để đối chứng, để môi trƣờng thạch nguội tự nhiên và dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Đem tất cả các đĩa vô tủ ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 48h thi lấy ra quan sát và nhận xét khả năng kháng nấm men.
Mọi thao tác đều đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 3 lần lặp lại và kết quả đƣợc lấy ở giá trị trung bình.
3.3.4. Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ép trích trái nhàu sống theo các tỷ lệ pha loãng cùng với cerevisiae của dịch ép trích trái nhàu sống theo các tỷ lệ pha loãng cùng với môi trƣờng nuôi cấy (ký hiệu: F)
Mục đích: khảo sát khả năng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae của dịch ép trích trái nhàu sống (trái nhàu: nƣớc là 1: 1) trong 24h theo các tỷ lệ pha loãng
cùng với môi trƣờng nuôi cấy để xác định khả năng kháng nấm men của dịch ép trích trái nhàu sống để so sánh, đối chiếu với các thí nghiệm sau.
Phƣơng pháp thực hiện
Lần 1: chuẩn bị 10 đĩa petri và 62 ml dịch trích trái nhàu sống, dịch nấm men 0,100g/40ml nƣớc muối sinh lý 0,85%
Ký hiệu (F 1: 1) (1 dịch trích trái nhàu (10ml) /1 môi trƣờng (10ml)) sử dụng ống đong để đong 30ml dịch ngâm trích trái nhàu sống và 30ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (F 1: 3) (1 dịch trích trái nhàu (7 ml) / 3 môi trƣờng (13 ml)) sử dụng ống đong để đong 21 ml dịch ngâm trích trái nhàu sống và 39 ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch ngâm trích và môi trƣờng không có pha dịch ngâm trích ở nhiệt độ 121 o
C trong 15 phút. Sau khi tiệt trùng xong, để nguội tự nhiên và tiến hành đỗ đĩa, khi tiến hành đỗ đĩa ta chỉ đỗ mỗi đĩa khoảng 20ml/đĩa, xoay nhẹ đĩa và để môi trƣờng đông lại tự nhiên. Khi môi trƣờng thạch đã nguội và đông đặc lại ta tiến hành cấy nấm men, dùng pipet hút 0,1ml dung dịch nấm men vào đĩa, sau đó dùng que trang tiến hành trang đều dịch nấm men trên bề mặt thạch và để khô tự nhiên.
Ký hiệu (F 1: 6) (1 dịch trích trái nhàu (3,5ml) / 6 môi trƣờng (16,5 ml)) sử dụng ống đong để đong 10,5 ml dịch ngâm trích trái nhàu sống và 49,5 ml môi trƣờng và cho vào một bình tam giác 250ml, lắc nhẹ để làm đều môi trƣờng với dịch trích trái nhàu và đậy lại bằng nút bông. Sau đó đem đi tiệt trùng môi trƣờng có pha dịch