57
Chất kháng sinh của chủng TM5.2 khá bền với nhiệt độ, tuy nhiên để tách chiết đạt hiệu quả cao chúng ta nên tách chiết ở nhiệt độ dƣới 50oC.
3.4.3. Tinh sạch chất kháng sinh bằng HPLC
Sau quá trình tinh sạch sơ bộ bằng dung môi hữu cơ, kháng sinh thô sau đó đƣợc cô quay và thu lấy cặn. Cặn này đƣợc phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp với các thông số nhƣ sau: cột C18 (4,6 x 250 mm), pha di động chứa methanol, và cột HPLC grade water bổ sung thêm 0.05% TFA. Bơm 50 µL dung dịch chiết vào cột, chạy cột từ 20 đến 40% methanol trong 10 phút, từ 40- 60 trong 5 phút từ 60-70% trong 10p ở tốc độ 0.5 mL, bƣớc sóng 200 nm. 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min -100 0 100 200 300 400 500 600 700 mAU 254nm,4nm (1.00)
Hình 3.11. Kết quả phân tích hợp chất thu đƣợc bằng sắc lý lỏng cao áp
Kết quả cho thấy, sau khi chất kháng khuẩn đƣợc tinh sạch qua HPLC thu đƣợc 5 peak chính. Chúng tôi tiến hành thu phân đoạn trong 3 phân đoạn chính từphút thứ 5-11, từ phút thứ 11-17 và phút thứ 19 để thử hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả phân đoạn 1 và 2 có hoạt tính, trong đó, phân đoạn 2 có 3 peak chính, tuy nhiên chỉ có peak thứ 2 có hoạt tính kháng khuẩn. Sau đó các phân đoạn này đƣợc thu và phân tích khối phổ.
3.4.4. Phân tích chất kháng khuẩn bằng khối phổ MS
Sau khi tinh sạch, mẫu đƣợc đƣa trực tiếp vào máy phân tích khối phổ để phân tích khối lƣợng phân tử.
58
So sánh với bảng dữ liệu khối lƣợng cho thấy: ở peak m/z 292,1 có khối lƣợng tƣơng đƣơng với apigeni thuộc nhóm flavonoid, peak m/z 1463.9 có khối lƣơng tƣơng đƣơng với chất dẫn xuất fengycin. Trong hai chất này thì fengycin thuộc nhóm lipopeptide vòng và đƣợc coi là chất kháng sinh chống nấm. Lần đầu tiên năm 1986 đƣợc Nongnuch Vannittanakom tách chiết từ vi khuẩn Bacillus subtilis F29-3, sau đó chủng Bacillus subtilis ATCC 21332 cũng đƣợc coi là chủng
đồng thời sản xuất hai lipopeptide vòng: surfactin và fengycin. Đây là nhóm lipopeptide đƣợc cấu tạo từ 7 (surfactin) hoặc 10 (fengycin) các axit amin liên kết với một axit béo kỵ nƣớc chuỗi C13-C17 (surfactin) hoặc C14-C18 (fengycin). Fengycin vừa là một chất hoạt động bề mặt sinh học vừa là một chất chống nấm mạnh mẽ, đặc biệt ức chế sự phát triển ở sợi nấm gây bệnh ở một số thực vật [5, 6].