Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Bổ sung nguồn nitơ khác nhau vào môi trƣờng thích hợp với các hàm lƣợng 1%: NaNO2, NaNO3, (NH4)2SO4, bột đậu tƣơng, cao nấm men, peptone. Các bƣớc tiếp theo tiến hành tƣơng tự nhƣ trên.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy lắc trên môi trƣờng với nguồn cacbon, nitơ, pH thích hợp, cứ sau 24h lại lấy mẫu để xác định OD, pH, hoạt tính enzym, hoạt tính kháng khuẩn.
2.2.7. Tách chiết các hợp chất trong dịch lên men vi khuẩn và dịch lên men quả táo mèo táo mèo
2.2.7.1 Phương pháp sắc ký cột
Khảo sát hệ dung môi rửa giải và pha rắn hấp phụ
Nhồi pha hấp phụ rắn (Silicagel 0,063-0,2mm, Florisil 100-200 U.S.mesh) vào cột xilanh cỡ 1 (d = 5mm) từng lƣợng nhỏ, lắc đều, thông số thiết kế cột đƣợc trình bày ở Bảng 2.1:
Bảng 2.1: Thông số thiết kế cột nhồi
Pha hấp phụ Khối lƣợng (g) Chiều cao cột nhồi (cm)
Silicagel 0,5 5
Florisil 0,6 5
Pha mẫu vào methanol nồng đô ̣ khoảng 0,01 g/ml rồi đƣa lên cô ̣t 0,2 ml dung dịch này. Đƣa cột lên hê ̣ thống chiết pha rắn và thƣ̉ nghiê ̣m sơ bô ̣ để khảo sát chất hấp phu ̣ và hê ̣ dung môi rƣ̉a giải.
Hê ̣ dung môi rƣ̉a giải đƣợc thƣ̉ nghiê ̣m là:
n-Hexan, Cloroform, Ethylaxetat, n-Butanol n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol n-Hexan, n-Butanol, Aceton, Nƣớc
Kết quả nghiên cƣ́u sơ bô ̣ thấy chất hấp phu ̣ silicagel và hê ̣ dung môi rƣ̉a giải n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol có thể tách phân đoa ̣n tƣơng đối tốt và phù
34
hơ ̣p. Do đó ta đi khảo sát quá trình tách phân đoa ̣n di ̣ch chiết táo mèo và di ̣ch lên men trên cô ̣t sắc ký nhồi to hơn.
Phân đoạn di ̣ch chiết trên sắc ký cột
- Nhồi cột: Silicagel đƣợc sấy ở 3000C trong 2h và để nguội trong bình hút ẩm sau đó nhồi cột có đƣờng kính 1cm, chiều cao là 22cm.
- Luyện cột: dùng metanol để hoạt hóa pha rắn, làm ƣớt để pha rắn có thể sẵn sàng tiếp xúc và tƣơng tác với các chất tan. Tránh không làm khô pha rắn trong và sau khi luyện cột.
- Cân bằng cột: tƣơng tự nhƣ bƣớc 2 (nhƣng phải dùng chính dung môi chứa mẫu nhƣ ban đầu để cho vào cột) dùng metanol.
- Đưa mẫu vào cột: pha các mẫu cao chiết trong methanol ở nồng đô ̣ 0,01g/ml. Đƣa 5ml dung dịch trên lên cột nhồi.
- Rửa giả i trên cột : dùng hệ dung môi rửa giải là : n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol vớ i tỷ lê ̣ phối trô ̣n khác nhau sao cho mƣ́c đô ̣ phân cƣ̣c tăng dần . Tốc độ dòng điều chỉnh sao cho thời gian tiếp xúc giữa dung môi rửa và pha rắn kéo dài trong 1-2 phút.
Kiểm tra các phân đoa ̣n trên sắc ký bản mỏng để thu gom các phân đoa ̣n có kết quả triển khai tƣơng tƣ̣ nhau trong cùng mô ̣t hê ̣ dung môi có kết quả gần giống nhau.
2.2.7.2. Phương phá p kiểm tra phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng
Sấy bản mỏng rồi cắt thành tƣ̀ng tấm theo kích thƣớc nhất đi ̣nh . Đánh dấu đƣờng xuất phát cách mép dƣới 0,5 –1 cm. Dùng ống mao quản hút dung d ịch mẫu thử rồi chấm lên b ản mỏng. Vết chấm phải tròn, gọn và đƣa đƣợc lƣ ợng mẫu phù hơ ̣p. Sau đó đặt bản mỏng đã chấm vào bình triển khai sắc ký với hê ̣ dung môi triển khai đã đƣ ợc bão hòa, đậy nắp bình. Sau khi dung môi chạy đến cách đầu trên của bản khoảng 0,5-1 cm thì lấy ra, đánh dấu mức dung môi trên bản mỏng, sấy khô bản mỏng rồi soi UV hoặc phun các thuốc thử hiện màu nhƣ dung d ịch H2SO4 10% rồi sấy khô cho dung môi bay hết để vết triển khai trên bản mỏng đƣợc hiện rõ.
35
Các hệ dung môi triển khai đã thử nghiệm khi nghiên cứ u các phân đoa ̣n trên bản mỏng bao gồm:
1. TEAF - Tuluen: Ethylacetae: Acetone: Acid Focmic = 5:3:1:1. 2. Ethylaxetat: axit focmic: nƣớc = 8:1:1
3. Toluen: Ethylaxetat: axit focmic = 5:4:1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4. [Axit acetic (2,4%) – Etanol –Acetonitril (35: 5: 10)] - Metanol : (70: 30) 5. Metanol – Axit acetic – Nƣớc (36,7%: 0,3%: 63%)
6. Axit acetic (0,28%) – Metanol – Acetonitril (35: 5: 10) 7.n-Butanol – Axit acetic – Nƣớc (85: 5: 10)
8.n-Butanol – Etyl acetat – Dimetyl formamit – Nƣớc (10: 6: 3: 2) 9. Toluen – Etyl acetat – Aceton – Axit formic (15: 2: 2: 1)
10.Benzen – Aceton (4:1): Benzen – Pyridin – Axit formic (36: 9: 5)
2.2.8. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết quả táo mèo và phân đoạn kháng khuẩn kháng khuẩn
2.2.8.1. Thử định tính flavonoit
Phản ứng Shinoda. Pha mẫu thử trong ethanol với một lƣợng thích hợp, bổ
sung vài giọt axit clohidric đặc và chia dung dịch thành hai ống nghiệm Ống 1: dùng làm đối chứng
Ống 2: thả vài mảnh Mg vào, đun trên ngọn lửa đèn cồn trong vài phút. Kết quả dƣơng tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
Phản ứng diazo hóa: Dung dịch thử đƣợc pha tƣơng tự nhƣ trên. Cũng chia
làm hai ống nghiệm
Ống 1: dùng làm đối chứng
Ống 2: cho vài 3-4 giọt thuốc thử diazo. Kết quả là dƣơng tính khi có xuất hiện màu da cam.
Phản ứng với dung dịch kiềm. cũng pha và chia dung dịch mẫu thử nhƣ trên
Ống 1: dùng làm đối chứng
Ống 2: nhỏ thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Kết quả dƣơng tính khi có màu vàng cam.
36
Phản ứng với axit sulfuric: cũng tiến hành pha và chia dung dịch mẫu thử tƣơng tự nhƣ trên
Ống 1: dùng làm đối chứng
Ống 2: Nhỏ bổ sung vài giọt axit sulfuric. Kết quả sẽ xuất hiện màu vàng đậm nếu dung dịch thử có chứa flavon hoặc flavonol.Màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
2.2.8.2. Thử định tính tannin
Phản ứng vanillin: cũng tiến hành pha dung dịch nhƣ trên
Ống 1: dùng làm đối chứng
Ống 2: Nhỏ thêm vài giọt thuốc thử vanillin/H2SO4. Kết quả dƣơng tính nếu dung dịch có màu đỏ thẫm.
Phản ứng gelatin/ NaCl: Cũng tiến hành tƣơng tự nhƣ trên nhƣng bổ sung
vào ống 2 vài giọt thuốc thử gelatin/NaCl. Kết quả dƣơng tính khi ống nghiệm có hiện tƣợng vẩn đục.
Phản ứng với acetate chì: Bổ sung vài giọt thuốc thử acetat chì 10% vào
dung dịch mẫu thử với cách pha tƣơng tự nhƣ trên. Kết quả là dƣơng tính thì sẽ xuất hiện kết tủa.
Phản ứng với FeCl3 1% trong nước. Cách pha mẫu và phân chia mẫu tƣơng
tự nhƣ trên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ống 1: dùng làm đối chứng
Ống 2: đổ vào ống nghiệm chứa thuốc thử đƣợc pha loãng bằng cồn 96%. Kết quả dƣơng tính khi dung dịch có màu xanh, tím hoặc xanh đen.
2.2.8.3. Thử định tính ankaloit
Phản ứng Dragendrorff cải tiến.
Lấy lƣợng 0.01g cao dịch chiết trong 1ml CH3COOH 2%, lọc để thu dịch lọc. Lấy khoảng 1ml mẫu thử cho vào ống nghiệm
37
Ống 2: nhỏ từ từ thuốc thử vào ống 2. Thành phần thuốc thử gồm có Bi (NO3)3 và KI trong dung dịch acid axetic. Kết quả dƣơng tính sẽ cho kết tủa màu đỏ da cam hay đỏ gạch.
2.2.8.4. Thử định tính glicozit
Phản ứng Keller- Killian
Dung dịch 1: 50 ml CHCOOH 10% + 5,5 ml dung dịch FeCl3 5% Dung dịch 2: 50ml H2SO4 đặc + 0,5 ml dung dịch FeCl3 5%
Lấy 0,01g cao chiết ở các phân đoạn cho vào ống nghiệm. Sau đó, bổ sung 1 ml dung dịch 1, lắc cho hòa tan hết, nghiêng ống nghiệm khoảng 450 rồi nhỏ từ từ dung dịch 2 vào. Kết quả dƣơng tính khi phản ứng cho màu đỏ nâu giữa hai lớp chất lỏng.
2.2.8.5. Phƣơng pháp sắc ký HPLC
Dịch kháng sinh thô sau khi tách chiết với Ethylacetate, rồi cô quay.
HPLC sử dụng cột C18(4,6 x 250 mm), pha di động chứa methanol, và cột HPLC grade water bổ sung thêm 0.05% TFA. Bơm 50 µL dung dịch chiết vào cột. Chạy cột từ 20 đến 40% methanol trong 10p, từ 40%- 60% trong 5p từ 60%-70% trong 10p ở tốc độ 0.5 mL, bƣớc sóng 200 nm.
38
2.2.8.5. Xác định hợp chất kháng sinh bằng phƣơng pháp khối phổ MS
Chất kháng khuẩn có khả năng kháng M.catarrhalis đƣợc tinh sạch thông
qua hệ thống HPLC đƣợc phân tích khối lƣợng phân tử bởi phƣơng pháp khối phổ MS. Mẫu đƣợc đƣa trực tiếp vào khối phổ trong trạng thái tích điện dƣơng. Sau quá trình tinh sạch sơ bộ bằng dung môi hữu cơ, kháng sinh thô sau đó đƣợc cô quay và thu lấy cặn. Cặn này đƣợc phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp với các thông số nhƣ sau: cột C18 (4,6 x 250 mm), pha di động chứa methanol, và cột HPLC grade water bổ sung thêm 0.05% TFA. Bơm 50 µL dung dịch chiết vào cột, chạy cột từ 20 đến 40% methanol trong 10 phút, từ 40- 60 trong 5 phút từ 60-70% trong 10p ở tốc độ 0.5 mL, bƣớc sóng 200 nm.
Sơ đồ thí nghiệm