Đối với hợp chất có hai dây carbon dài nhƣ hợp chất ceramide việc xác định cấu trúc phải vừa dựa vào phƣơng pháp phổ nghiệm vừa dựa vào kết quả thủy giải để khảo sát từng dây béo trong hợp chất.
Methanol giải bằng dung dịch acid trong methanol để phân cắt nối amide trong hợp chất. Trong trƣờng hợp phân tử có chứa nối đôi thì lại tiến hành phản ứng oxi hóa nối đôi bằng dung dịch KMnO4 để xác định cấu trúc mạch carbon.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 21
Chƣơng 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phƣơng tiện
3.1.1 Hóa chất
Bảng 3.1 Danh mục hóa chất.
Hóa chất Nhà sản xuất Xuất xứ
Pertroleum ether Chemsol Việt Nam
Hexane Chemsol Việt Nam
Chloroform Chemsol Việt Nam
Ethyl acetate Chemsol Việt Nam
Acetone Chemsol Việt Nam
Methanol Chemsol Việt Nam
Na2SO4 khan Xilong Trung Quốc
Lớp mỏng silica gel 60 F254 Merck Đức
Silica gel 60 Scharlau Tây Ban Nha
Silica gel 60 Merck Đức
3.1.2 Dụng cụ, thiết bị
Tủ sấy Ecocell, buồng soi UV
Đèn cồn, ống mao quản
Cột sắc ký, giá đỡ
Bếp điện ALAMA
Bình lóng, phễu chiết
Máy cô quay Heidolph
Bình cầu, cốc thủy tinh, ống đong, pipet, lọ thủy tinh,…
3.2 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài đƣợc triển khai từ tháng 12/2014 đến tháng 4/2015.
Địa điểm: phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ 1 và Hóa sinh 2, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, trƣờng Đại Học Cần Thơ.
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Phƣơng pháp chiết xuất 3.3.1 Phƣơng pháp chiết xuất
Chiết là phƣơng pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Các phƣơng pháp chiết rắn - lỏng, lỏng - lỏng hoặc kết hợp cả hai thƣờng
đƣợc sử dụng.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 22
Phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng dùng điều chế các loại cao, sử dụng bình lóng để lắc chiết.
3.3.2 Phƣơng pháp phân lập các hợp chất
Các phƣơng pháp chung đƣợc áp dụng để phân lập những hợp chất sạch chủ yếu là các phƣơng pháp sắc ký bao gồm sắc ký cột nhanh khô, sắc ký cột hở kết hợp với sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình sắc ký. Ngoài ra, đề tài còn sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng điều chế và phƣơng pháp kết tinh trong dung môi thích hợp.
3.3.3 Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc của các hợp chất
Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ đƣợc xác định những hằng số lý hoá đặc trƣng nhƣ: màu sắc, Rf, nhiệt độ nóng chảy, tan tốt trong những dung môi nào,…
Sau đó để xác định cấu trúc các hợp chất sẽ sử dụng các phƣơng pháp phổ hiện đại nhƣ: phổ khối lƣợng (Mass Spectroscopy), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, 1
D-NMR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy,
2D-NMR) tùy theo từng hợp chất.
3.3.4 Phƣơng pháp xác định cấu trúc
Đo nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực, gửi mẫu ghi phổ NMR tại Viện Khoa học và Công Nghệ Quốc gia – Số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội.
Giải phổ, so sánh với các tài liệu tham khảo và xác định cấu trúc.
3.4 Thực nghiệm
3.4.1 Thu hái và xử lí nguyên liệu Thu hái nguyên liệu: Thu hái nguyên liệu:
Thân và lá của cây ô rô thu tại vùng nƣớc lợ thuộc huyện Càng Long, tỉnh Trà Vinh.
Xử lí nguyên liệu:
Thân và lá cây ô rô sau khi thu hái đƣợc rửa sạch, chặt nhỏ, phơi trong mát đến khô, sấy ở 60°C đến khi khối lƣợng không đổi và nghiền thành bột mịn. Khối lƣợng mẫu sau khi sấy khô thu đƣợc mẫu có khối lƣợng 12 kg.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 23
Hình 3.1 Mẫu cây ô rô sau khi thu hái và đƣợc chặt nhỏ phơi khô.
3.4.2 Điều chế các loại cao
Hình 3.2 Quy trình điều chế các cao phân đoạn từ cao methanol. Loại bỏ thân và lá sâu, hƣ
Rửa sạch, phơi trong mát đến khô Sấy ở 60oC và nghiền mịn
Bột nguyên liệu
Cao methanol
Ngâm dầm với methanol Cô quay đuổi dung môi
Chiết lỏng – lỏng với pertroleum ether
Cao PE Dịch chiết còn lại
Cao chloroform
Cao Ea Dịch chiết còn lại không khảo sát Chiết lỏng – lỏng với ethyl acetate Chiết lỏng – lỏng với chloroform
Dịch chiết còn lại
Thân và lá cây Ô rô tƣơi
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 24
3.4.2.1 Điều chế cao tổng (cao methanol)
Cho các túi vải vào bình thủy tinh ngâm mẫu (bình 10 lít), sau đó thêm lƣợng methanol cho đến khi vừa ngập các túi bột mẫu, đậy bình thủy tinh bằng một túi ni lông và khóa chặt bằng nắp bình.
Sau 24 giờ, ta lấy các túi mẫu ra ngoài sẽ thu đƣợc dịch chiết. Các túi mẫu đƣợc cho trở lại bình ngâm mẫu và tiếp tục cho lƣợng methanol vừa đủ nào ngâm tiếp 24 giờ nữa. Dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc để loại bỏ phần bột mẫu mịn qua đƣợc lớp vải. Tiếp đó, đem cô quay dịch lọc để thu hồi dung môi cho lần ngâm mẫu tiếp theo. Sau khi cô cạn dịch lọc, hút phần dịch còn lại trong bình cô quay ngoài ta thu đƣợc cao tổng.
Quá trình này đƣợc lập lại đến lần thứ 4 thì màu của dịch chiết đã rất nhạt và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy không còn vết nên không tiếp tục chiết lần thứ 5 nữa.
Khối lƣợng cao tổng thu đƣợc là 943,50 g. Hiệu suất điều chế cao tổng:
Cao tổng sau khi đƣợc điều chế xong sẽ đƣợc cho thêm một ít methanol rồi cho vào tủ lạnh để bảo quản tránh sự xâm hại của các vi sinh vật và thực hiện các giai đoạn sau.
3.4.2.2 Điều chế cao phân đoạn từ cao tổng
Bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng cao tổng lần lƣợt với các dung môi hữu cơ ta sẽ thu đƣợc các cao phân đoạn. Trong phạm vi luận văn này, tiến hành điều chế cao PE, cao chloroform và cao Ea. Phần dịch còn lại sau quá trình chiết lỏng – lỏng với các dung môi trên đƣợc lƣu trữ lại có thể không khảo sát hoặc có thể dùng để sắc ký cột pha đảo.
3.4.2.3 Điều chế cao PE
Sử dụng bình lóng 500 mL để chiết lỏng – lỏng. Đầu tiên, ta hòa tan cao tổng khô bằng một lƣợng methanol tối thiểu. Mỗi lần chiết, ta cho vào bình lóng khoảng 50 g cao methanol ở dạng lỏng và cho nƣớc vào tƣơng đƣơng thể tích của 50 g cao trên theo tỉ lệ 1:1. Sau đó, ta cho thêm vào bình lóng từ 200 – 300 mL PE, lắc đều bình để các thành phần trong cao tổng phân bố đều ở hai pha. Để yên bình lóng trên giá khoảng 15 phút cho dung dịch phân lớp. Lấy lớp PE phía trên còn dịch nƣớc phía dƣới tiếp tục chiết với PE, quá trình chiết đƣợc lặp lại nhiều lần đến khi ta thấy lớp PE không màu nữa và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng thấy không còn vết nữa thì kết thúc.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 25
Quá trình chiết trên cũng thực hiện trên lƣợng cao tổng còn lại. Đồng thời, dịch PE đƣợc gom lại, cô quay thu hồi dung môi ta thu đƣợc cao PE. Cao PE sau khi khô hoàn toàn ta thu đƣợc khối lƣợng là 454,37 g.
Hiệu suất chiết cao PE:
3.4.2.4 Điều chế cao chloroform
Dịch nƣớc còn lại sau khi chiết với PE sẽ đƣợc chiết với chloroform. Quá trình chiết với chloroform cũng tƣơng tự nhƣ chiết với PE chỉ khác là do dịch nƣớc sau khi chiết với PE đã có nƣớc rồi ta không cần thêm nƣớc nữa. Do tỉ trọng của chloroform nặng hơn nƣớc nên khi chiết với chloroform ta lấy lớp chloroform ở dƣới, lớp nƣớc ở phía trên sẽ tiếp tục chiết với chloroform đến khi lớp chloroform ở dƣới nhạt màu đồng thời kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng không còn vết gì thì dừng lại.
Phần dịch chloroform (lớp dƣới) sẽ đƣợc gom lại cô quay thu hồi dung môi, ta thu đƣợc cao chloroform. Sau khi cao khô, khối lƣợng cao là 62,13 g.
Hiệu suất điều chế cao chloroform từ cao methanol là:
3.4.2.5 Điều chế cao Ea
Sau khi chiết với chloroform, dịch nƣớc đƣợc tiếp tục chiết với Ea. Quá trình chiết vẫn tƣơng tự nhƣ chiết với chloroform, nhƣng ta lấy lớp Ea phía trên do tỉ trọng của Ea nhỏ hơn nƣớc. Các công đoạn sau thực hiện tƣơng tự nhƣ chiết với chloroform. Khối lƣợng cao khô thu đƣợc là 41,31 g.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 26 Hiệu suất điều chế cao Ea từ cao methanol là
Dịch nƣớc sau khi chiết với Ea đƣợc lƣu giữ lại, không khảo sát tiếp.
3.4.3 Khảo sát cao cloroform
Sử dụng SKC để tách và tinh chế các hợp chất.
Dò tìm hệ dung môi giải ly cột hiệu quả nhất và kiểm tra sự tinh khiết của các hợp chất thông qua SKLM.
Tiến hành khảo sát tiếp tục cao chloroform và PE.
3.4.3.1 Sắc ký nhanh – cột khô cao chloroform
Sử dụng phƣơng pháp sắc ký nhanh – cột khô để phân tích cao chloroform có khối lƣợng 62,13 g, sử dụng silica gel Merck 60, cột sắc ký có đƣờng kính 12,5 cm, thể tích cột 1 lít.
Đầu tiên, tiến hành tiền hấp phụ 62,13 g cao chloroform với 80 g Silica gel khô.
Từ kết quả SKLM cao chloroform bên dƣới, ta thực hiện sắc ký nhanh – cột khô với hệ dung môi giải ly đầu tiên là Hex:Ea (5:5), sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi bằng cách tăng dần tỉ lệ Ea. Mỗi lần giải ly cột, thể tích dung môi dùng là 500 mL. Dung dịch ra khỏi cột đƣợc hứng trong các bình tam giác.
Hình 3.4 Kết quả SKLM cao chlorofrom với hệ giải ly Hex:Ea (5:5). Theo dõi quá trình giải ly cột bằng SKLM để gom các phân đoạn, cô quay dung dịch, thu hồi và làm khan dung môi. Dung môi đƣợc làm khan tiếp tục dùng để giải ly cột.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 27
Hình 3.5 Giải ly cột sắc ký nhanh – cột khô.
Kết quả sắc ký nhanh - cột khô cao chloroform đƣợc trình bày trong Bảng 3.2.
Hiệu suất sắc ký nhanh – cột khô cao chloroform:
Bảng 3.2 Kết quả sắc ký nhanh – cột khô cao chloroform Phân
đoạn Dung môi giải ly
Khối lƣợng
(g)
Kết quả SKLM*
C-I Hex:Ea (5:5) 5,30 Nhiều vết + viết tím tròn Rf = 0,5 C-II Hex:Ea (5:5) 4,63 Vết cam to Rf = 0,4 + nhiều vết
C-III Hex: Ea (5:5) 7,23 Nhiều vết + vết xanh dƣơng
Rf = 0,6
C-IV Hex:Ea (4:6) 4,18 Nhiều vết, vàng tròn Rf = 0,8 C-V Hex:Ea (4:6) 4,06 Bốn vết: 2 vết vàng, tím, hồng to
Rf = 0,35
C-VI Hex:Ea (2:8) và Hex:Ea (1:9) 6,20 Vết xanh Rf = 0,5 + nhiều vết C-VII Hex:Ea (1:9) Ea (100%) 6,57 Vết xanh Rf = 0,1 + kéo vệt C-VIII Ea (100%) 4,71 Vết nâu Rf = 0,3 + kéo vệt C-IX Ea:Me (9:1) và Ea: Me (8:2) 5,92 Kéo vệt dài
C-X Me (100%) 4,32 Kéo vệt dài * Kết quả SKLM đƣợc hiện hình trong vanillin/H+.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 28
3.4.3.1 Khảo sát phân đoạn C-III
Phân đoạn C-III (7,23g) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột nhanh khô với hệ
dung môi giải ly Hex:Ea (95:5) đến E 100% thu đƣợc 12 phân đoạn từ C-
III.1–C-III.12. Phân đoạn C-III.8 (1,321g) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột
thƣờng với dung môi giải ly Hex:Ea (7:3) thu đƣợc 8 phân đoạn C-III.8.1- C-
III.8.8. Phân đoạn C-III.8.5 đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột pha thƣờng với
dung môi giải ly cloroform 100% thu đƣợc hợp chất AiliM1 (5mg), sắc ký lớp
mỏng với hệ dung môi C:M (9:1) có trị số Rf = 0,7 hiện 1 vết tròn màu vàng
tƣơi trong vaniline, vết màu nâu đen trong thuốc thữ Fe3+, bắt UV ở bƣớc sóng
254nm.
Hình 3.6 Sắc ký lớp mỏng AiliM1 hệ: PE:Ea (7:3), C:Ea (7:3) và C:M (9:1), hiện hình trong thuốc thử FeCl3 và soi UV ở bƣớc sóng 254nm.
3.4.4 Khảo sát cao PE
3.4.4.1 Sắc ký nhanh – cột khô cao PE
Bảng 3.3 Kết quả sắc ký nhanh – cột khô cao PE
Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lƣợng (g) Kết quả SKLM* PE-I PE:Ea (8:2) 50,59 Cho viết màu xanh Rf = 0.9 PE-II PE:Ea (7:3) 9,67 Vết chính nâu tím Rf = 0,4 PE-III PE:Ea (5:5) 8,45 Vết chính màu nâu đen Rf = 0,4 PE-IV PE:Ea (2:8) 13,54 Vết màu chính màu cam Rf = 0,3
PE-V Ea 100 15,32 Kéo vệt có 1 vết màu đen Rf = 0,4
PE-VI Ea:Me (9:1) 9,15 Vết chính màu hồng kéo vệt
Rf = 0.4 và vết tím Rf = 0,5
PE-VII Ea:Me (8:2) 20,89 Kéo vệt trên bảng và có vết màu đen Rf = 0,3 PE-VIII Ea:Me (5:5) 92,72 Kéo vệt trên bảng
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 29
Kết quả sắc ký nhanh – cột khô cao PE ta thu đƣợc 8 phân đoạn trình bày trong Bảng 3.3.
Hiệu suất sắc ký nhanh – cột khô cao PE:
3.4.4.2 Khảo sát phân đoạn PE-VI
Phân đoạn PE-VI (9,15g) tiếp tục đƣợc tinh chế bằng sắc ký pha thƣờng với hệ dung môi giải ly PE:Ea (8:2) đến Ea 100% thu đƣợc 6 phân đoạn từ PE- VI.1– PE-VI.6. Phân đoạn PE-VI.3 (1,895g) đƣợc làm tinh chế bằng sắc ký cột thƣờng với dung môi giải ly PE:Ea (8:2) thu đƣợc 4 phân đoạn PE-VI.3.1- PE-VI.3.4. Phân đoạn PE-VI.3.4 đƣợc kết tinh lại trong dung môi MeOH thu đƣợc hợp chất tinh thể màu trắng (10 mg), đƣợc giải ly sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi C:M (9:1) có trị số Rf = 0,5 hiện 1 vết tròn màu hồng trong vaniline.
Hình 3.7 Sắc ký lớp mỏng AiliM2 trong 3 hệ và C:M (95:5), C:Ea:Ac (1:1:0,5), Ea:Me (9:1)
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 30
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả
Mẫu nguyên liệu đƣợc tiến hành thu hái tại huyện Càng Long, tỉnh Trà Vinh. Sau khi thu hái, thân và lá cây ô rô đƣợc rửa sạch, loại bỏ lá có sâu bọ hƣ hại, chặt nhỏ. Phơi trong mát đến khô, sấy ở 60oC đến khi khối lƣợng không đổi. Sau khi nghiền mịn ta thu đƣợc 10 kg bột mẫu.
Bột mẫu đƣợc chiết rắn – lỏng với methanol để thu cao tổng. Tiếp đó, cao tổng đƣợc chiết lỏng – lỏng lần lƣợt với các dung môi PE, chloroform, Ea thu đƣợc các cao phân đoạn có độ phân cực khác nhau.
Kết quả các loại cao với khối lƣợng: 934,50 g cao tổng và 454,37 g cao PE, 62,13 g cao chloroform, 41,31 g cao Ea.
Từ phân đoạn cao chloroform cô lập đƣợc hợp chất AiliM1. Gửi chất AiliM1 đo phổ, từ các dữ liệu phổ, tiến hành giải đoán cấu trúc và xác định đƣợc AiliM1 là 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one hay thƣờng đƣợc gọi là Apigenin.
Từ phân đoạn cao PE cô lập đƣợc hợp chất AiliM2. Gửi chất AiliM2 đo phổ, từ các dữ liệu phổ, bƣớc đầu khảo sát cấu trúc hợp chất AiliM2 là một ceramide. Nhƣng vì lƣợng mẫu ít và không đủ thời gian thực hiện tiếp nên công thức và tên của hợp chất vẫn chƣa xác định đƣợc 1 cách chính xác.
4.2 Biện luận cấu trúc
4.2.1 Biện luận phổ hợp chất AiliM1
Phổ 1
H-NMR (500MHz, Acetone-D6)
Độ dịch chuyển của các tín hiệu proton từ δ = 6,25 ppm đến δ = 7,3 ppm đặc trƣng cho tín hiệu proton của vòng benzene và proton của vinyl.
Từ đó ta đƣa ra đƣợc các dự đoán nhƣ sau:
Có 2 cặp proton tƣơng đƣơng từ với nhau.
Tín hiệu proton δ = 7,02 ppm (chẻ mũi dd) có J1= 2 Hz (chẻ meta) và
J2 = 7 Hz (chẻ ortho)
Tín hiệu proton δ = 7,03 ppm (chẻ mũi dd) có J1= 2 Hz (chẻ meta) và
J2 = 7 Hz (chẻ ortho)
Tín hiệu proton δ = 6,25 ppm (chẻ mũi d) có J = 2 Hz (chẻ meta)
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 31
Tín hiệu proton δ = 6,62 ppm mũi đơn => xung quanh không có proton
Tín hiệu proton δ = 13 ppm đặc trƣng cho proton của –OH kèm nối:
Phổ 13C-NMR (125 MHz, Acetone-D6) và phổ DEPT
Ta biết đƣợc tín hiệu carbon có δ nằm trong khoảng 110-150 là của >C=C< và 100-175 là của nhân thơm.
Trên phổ 13C-NMR tín hiệu carbon nẳm trong khoảng 95-175 => Các carbon nằm trên vòng benzene hoặc của -C=C- trong đó các tín hiệu các carbon gắn với O và nhóm >C=O nằm ở vùng trƣờng thấp hơn nhiều từ 158,8 ppm đến 163,6 ppm so với các carbon còn lại từ 99,73 ppm đến 129,25 ppm.
Tín hiệu có δ = 183 ppm là của nhóm >C=O.
