Bảng 2.1 công thức và tên một số hợp chất trong cây ô rô hoa tím
Công thức Tên hợp chất
(+)-Lyoniresinol3a-O-- glucopyranoside
α-Amyrin
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 14
Công thức Tên hợp chất
(Z)-4-Coumaric acid 4-O- β-D-glucopyranoside 7-Chloro-(2R)-2-O-β-D- glucopyranosyl-2H-1,4- benzoxazin- 3(4H)-one Dihydroxymetyl-bis(3,5 dimethoxy-4-hydroxy phenyl) tetrahydrofuran-9 (hoặc 9’)-O-β- glucopyranoside. (2S,3R,6S)-2-((4-(3-Ethyl- 4,5-dihydroxyphenyl)-5,7- dihydroxy-2 (hydroxymethyl)-6- methyl-1,2,3,4- tetrahydronaphthalen-1- yl)methoxy)-4-hydroxy- 6(hydroxymethyl)-3,6- dihydro(2H)-pyran-3-yl 3,4-dihydroxy -2-methoxybenzoate) (+)-lyoniresinol 3a-O-α-D- galactopyranosyl-(1→6)-β- D-glucopyranoside 2.4 Nhóm hợp chất flavonoid 2.4.1 Giới thiệu về flavonoid[19]
Flavonoid hoặc fioflavonoid bắt nguồn từ Latin, flavus nghĩa là màu vàng, màu của flavonoid trong tự nhiên là 1 loại chất chuyển hóa trung gian
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 15
của thực vật. Tuy nhiên một số flavonoid có màu xanh, tím đỏ và cũng có một số khác lại không có màu.
Về mặt hóa học, flavonoid là những hợp chất có cấu trúc chung là môt khung cơ bản có 15C, gồm 2 vòng phenyl (A và B) và một dị vòng thơm (C). Có thể viết tắt là C6-C3-C6:
Hình 2.7 Khung cơ bản của nhóm hợp chất flavonoid
2.4.2 Hoạt tính dƣợc lý của flavonoid
Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng. Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thƣờng là các gốc tự do nhƣ OH•, ROO• (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thƣ, tăng nhanh sự lão hoá,…).
Các flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá mà các kim loại tạo ra. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thƣơng do bức xạ.
Hyaluronidase là enzyme làm tăng tính thấm của mao mạch, khi thừa enzyme này sẽ xảy ra hiện tƣợng xuất huyết dƣới da. Flavonoid ức chế sự hoạt động của hyaluronidase, vì thế, nếu đƣợc bổ sung flavonoid, tình trạng trên sẽ cải thiện. Phối hợp với vitamin C, flavonoid của hoa hoè (rutin) sẽ tăng cƣờng tác dụng trị liệu.
Những nhà nghiên cứu cũng đã chỉ ra những tác động của thực phẩm giàu flavonoid với những nguy cơ về tim mạch nhƣ huyết áp cao. Flavonoid làm bền thành mạch, đƣợc dùng trong các trƣờng hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch trĩ, rối loạn tuần hoàn võng mạc.
Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thƣơng tổn gan, bảo vệ chức năng gan.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 16
Nhiều flavonoid thuộc nhóm flavone, flavanone, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt, đó là các flavonoid có trong lá diếp cá, trong cây râu mèo,…
Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid nhƣ quercetin, rutin, myricetin, hỗn hợp các Catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích phút của tim.
Cao chiết từ lá bạch quả (Ginko biloba) chứa các chất của kaempferol,
quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những ngƣời có biểu hiện lão suy, rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung, hay cáu gắt,...
Flavonoid là một trong những nhóm chất hứa hẹn cho việc điều trị bệnh ung thƣ. Nhiều nghiên cứu dịch tễ học đã đề cập đến flavonoid có thể làm giảm và ngăn chặn sự tác động của nhiều căn bệnh ung thƣ khác nhau.
Apigenin có hoạt tính kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng ung thƣ (ung thƣ tuyến tiền liệt và biểu bì tuyến tiền liệt, ung thƣ vú), kháng khuẩn.
2.4.3 Quy trình sinh tổng hợp flavonoid
Hầu hết các flavonoid đều chứa một dị vòng thơm đƣợc hình thành từ sự tác kích thân hạch theo kiểu phản ứng Michael của nhóm –OH phenol của vòng A vào ketone bất bảo hòa tạo ra flavanone. Flavanone có thể cho ra nhiều các dẫn xuất dựa trên khung cơ bản đó, ví dụ: flavone, flavonol, anthocyanidine và catechine.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 17
Hình 2.8 Quá trình sinh tổng hợp Flavonoid Flavanone synthase II O2, 2-oxo-glularate Flavon synthase II O2, NADPH R’ = H, R’’ = H : galagin R’ = H, R’’ = OH : kaempferol R’ = OH, R’’ = OH : quecetin R’ = H, R’’ = H : chrysin R’ = OH, R’’ = OH : luteolin R’ = H, R’’ = OH : apigenin O2, 2-oxy-glularate Flavone-3-hydroxylase Flavanone synthase O2, 2-oxo-glularate R = H, R’= H : cinnamol CoA R = H, R’= OH : p-hydroxycinnamoyl CoA R = OH, R’= OH: 3,4-hydroxycinnamoyl CoA
Acetyl CoA Acetyl CoA
Chalcone isomerase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 18
2.5 Nhóm hợp chất ceramide 2.5.1 Giới thiệu 2.5.1 Giới thiệu
Ceramide là một nhóm sphingolipid đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Một ceramide gồm sphingosine và acid béo (có thể là bão hòa hay không bão hòa) có độ dài chuỗi phổ biến (14-26 carbon) đƣợc liên kết thông qua liên kết amide với C-2 của chuỗi sphingosine.
Ceramide thƣờng gặp trong một số loài thực vật nhƣ cây rau má Hydrocotyle leucocephala, họ Ngò (Apiaceae), cây Chùy hoa tổng bao Strobilanthes involucrate Bl., họ Ô rô (Acanthaceae); cây Bắt ruồi Drosera indica L., họ Trƣờng lệ (Droseraceae),…
Ceramide đƣợc tìm thấy ở nồng độ cao trong màng tế bào của các tế bào. Là một trong những thành phần chất béo tạo nên sphingomyelin, một trong những chất béo quan trọng trong màng lipid,…
Hình 2.9 Ceramide đƣợc phân lập trong sao biển Asterias amurensis
Hình 2.10 Ceramide đƣợc cô lập từ vỏ của cây Ficus mucuso
2.5.2 Vai trò sinh lý của Ceramide
Ceramide nhƣ một lipid có hoạt tính sinh học, nó liên quan đến một loạt các chức năng sinh lý: sự tăng trƣởng tế bào, sự chết đƣợc lập trình của tế bào (apoptosis), sự lão hóa của tế bào,…
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 19
2.5.3 Sinh tổng hợp ceramide
Có ba con đƣờng lớn để sinh tổng hợp ceramide. Con đƣờng thủy phân sphingomyelin: sử dụng enzyme sphingomyelinase để phá vỡ sphingomyelin trong màng tế bào và tạo ra ceramide. Con đƣờng de novo tạo ceramide từ các phân tử ít phức tạp hơn.
Ceramide cũng có thể đƣợc tạo thành thông qua sự phân hủy của sphingolipids phức tạp mà cuối cùng đƣợc chia thành sphingosine, sau đó đƣợc tái sử dụng bởi sự acyl hóa để tạo thành ceramide. Con đƣờng sau này đƣợc gọi là con đƣờng hoàn nguyên.
2.5.3.1 Thủy phân sphingomyelin
Sử thủy phân của các sphingomyelin đƣợc xúc tác bởi enzyme sphingomyelinase.
Sphingomyelin là một trong bốn nhóm chất đƣợc phospholipids tìm thấy trong màng tế bào, các tác động của con đƣờng này tạo ceramide là của các tín hiệu ngoại bào dẫn đến chết tế bào đƣợc lập trình. Có nghiên cứu cho thấy rằng những bức xạ ion hóa gây ra sự chết có lập trình của một số tế bào, các bức xạ dẫn tới sự kích hoạt của enzyme sphingomyelinase dẫn đến sự tạo thành ceramide.
2.5.3.2 Đƣờng sinh tổng de novo
De novo đòi hỏi sự phối hợp của serine palmitoyl transferase và
ceramide synthase để tạo ceramide.
Quá trình này bắt đầu với sự ngƣng tụ của serine và palmitoyl-CoA để tạo thành 3-ketosphinganine mà sau đó bị khử thành dihydrosphingosine. Sau đó đƣợc acyl hóa bởi những enzyme (ceramide synthase) để tạo thành dihydroceramide.
Sự thêm vào của liên kết đôi bởi enzyme desaturase dihydroceramide chuyển đổi dihydrosphingosine tạo thành ceramide (dihydrosphingosine bị acyl hóa). Đƣờng sinh tổng de novo có thể đƣợc kích thích bởi các loại thuốc và bức xạ ion hóa.
2.5.3.3 Con đƣờng hoàn nguyên (salvage pathway)
Sự phân rã cấu trúc của spingolipid và glycosphingolipids diễn ra ở khoang dƣới tế bào (có tính acid). Trong trƣờng hợp của các glycosphingolipid sẽ tạo thành theo từng bƣớc của các đơn vị monosaccharide
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 20
từ cuối chuỗi oligosaccharide, dẫn đến việc tạo ra ceramide trong khi sphingomyelin đƣợc chuyển thành ceramide bởi enzyme sphingomyelinase.
Ceramide có thể bị thủy phân hơn nữa bởi enzyme ceramidase để tạo thành sphingosine và một acid béo tự do. Chuỗi sphingosine có thể đi vào con đƣờng sinh tổng hợp ceramide hoặc sphingosine-1-phosphate.[16]
Hình 2.11 Sơ đồ sinh tổng hợp ceramide.
2.5.4 Phƣơng pháp methanol giải ceramide
Đối với hợp chất có hai dây carbon dài nhƣ hợp chất ceramide việc xác định cấu trúc phải vừa dựa vào phƣơng pháp phổ nghiệm vừa dựa vào kết quả thủy giải để khảo sát từng dây béo trong hợp chất.
Methanol giải bằng dung dịch acid trong methanol để phân cắt nối amide trong hợp chất. Trong trƣờng hợp phân tử có chứa nối đôi thì lại tiến hành phản ứng oxi hóa nối đôi bằng dung dịch KMnO4 để xác định cấu trúc mạch carbon. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 21
Chƣơng 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phƣơng tiện
3.1.1 Hóa chất
Bảng 3.1 Danh mục hóa chất.
Hóa chất Nhà sản xuất Xuất xứ
Pertroleum ether Chemsol Việt Nam
Hexane Chemsol Việt Nam
Chloroform Chemsol Việt Nam
Ethyl acetate Chemsol Việt Nam
Acetone Chemsol Việt Nam
Methanol Chemsol Việt Nam
Na2SO4 khan Xilong Trung Quốc
Lớp mỏng silica gel 60 F254 Merck Đức
Silica gel 60 Scharlau Tây Ban Nha
Silica gel 60 Merck Đức
3.1.2 Dụng cụ, thiết bị
Tủ sấy Ecocell, buồng soi UV
Đèn cồn, ống mao quản
Cột sắc ký, giá đỡ
Bếp điện ALAMA
Bình lóng, phễu chiết
Máy cô quay Heidolph
Bình cầu, cốc thủy tinh, ống đong, pipet, lọ thủy tinh,…
3.2 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài đƣợc triển khai từ tháng 12/2014 đến tháng 4/2015.
Địa điểm: phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ 1 và Hóa sinh 2, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, trƣờng Đại Học Cần Thơ.
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Phƣơng pháp chiết xuất 3.3.1 Phƣơng pháp chiết xuất
Chiết là phƣơng pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Các phƣơng pháp chiết rắn - lỏng, lỏng - lỏng hoặc kết hợp cả hai thƣờng đƣợc sử dụng.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 22 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng dùng điều chế các loại cao, sử dụng bình lóng để lắc chiết.
3.3.2 Phƣơng pháp phân lập các hợp chất
Các phƣơng pháp chung đƣợc áp dụng để phân lập những hợp chất sạch chủ yếu là các phƣơng pháp sắc ký bao gồm sắc ký cột nhanh khô, sắc ký cột hở kết hợp với sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình sắc ký. Ngoài ra, đề tài còn sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng điều chế và phƣơng pháp kết tinh trong dung môi thích hợp.
3.3.3 Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc của các hợp chất
Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ đƣợc xác định những hằng số lý hoá đặc trƣng nhƣ: màu sắc, Rf, nhiệt độ nóng chảy, tan tốt trong những dung môi nào,…
Sau đó để xác định cấu trúc các hợp chất sẽ sử dụng các phƣơng pháp phổ hiện đại nhƣ: phổ khối lƣợng (Mass Spectroscopy), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, 1
D-NMR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy,
2D-NMR) tùy theo từng hợp chất.
3.3.4 Phƣơng pháp xác định cấu trúc
Đo nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực, gửi mẫu ghi phổ NMR tại Viện Khoa học và Công Nghệ Quốc gia – Số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội.
Giải phổ, so sánh với các tài liệu tham khảo và xác định cấu trúc.
3.4 Thực nghiệm
3.4.1 Thu hái và xử lí nguyên liệu Thu hái nguyên liệu: Thu hái nguyên liệu:
Thân và lá của cây ô rô thu tại vùng nƣớc lợ thuộc huyện Càng Long, tỉnh Trà Vinh.
Xử lí nguyên liệu:
Thân và lá cây ô rô sau khi thu hái đƣợc rửa sạch, chặt nhỏ, phơi trong mát đến khô, sấy ở 60°C đến khi khối lƣợng không đổi và nghiền thành bột mịn. Khối lƣợng mẫu sau khi sấy khô thu đƣợc mẫu có khối lƣợng 12 kg.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 23
Hình 3.1 Mẫu cây ô rô sau khi thu hái và đƣợc chặt nhỏ phơi khô.
3.4.2 Điều chế các loại cao
Hình 3.2 Quy trình điều chế các cao phân đoạn từ cao methanol. Loại bỏ thân và lá sâu, hƣ
Rửa sạch, phơi trong mát đến khô Sấy ở 60oC và nghiền mịn
Bột nguyên liệu
Cao methanol
Ngâm dầm với methanol Cô quay đuổi dung môi
Chiết lỏng – lỏng với pertroleum ether
Cao PE Dịch chiết còn lại
Cao chloroform
Cao Ea Dịch chiết còn lại không khảo sát Chiết lỏng – lỏng với ethyl acetate Chiết lỏng – lỏng với chloroform
Dịch chiết còn lại Thân và lá cây Ô rô tƣơi
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 24 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.2.1 Điều chế cao tổng (cao methanol)
Cho các túi vải vào bình thủy tinh ngâm mẫu (bình 10 lít), sau đó thêm lƣợng methanol cho đến khi vừa ngập các túi bột mẫu, đậy bình thủy tinh bằng một túi ni lông và khóa chặt bằng nắp bình.
Sau 24 giờ, ta lấy các túi mẫu ra ngoài sẽ thu đƣợc dịch chiết. Các túi mẫu đƣợc cho trở lại bình ngâm mẫu và tiếp tục cho lƣợng methanol vừa đủ nào ngâm tiếp 24 giờ nữa. Dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc để loại bỏ phần bột mẫu mịn qua đƣợc lớp vải. Tiếp đó, đem cô quay dịch lọc để thu hồi dung môi cho lần ngâm mẫu tiếp theo. Sau khi cô cạn dịch lọc, hút phần dịch còn lại trong bình cô quay ngoài ta thu đƣợc cao tổng.
Quá trình này đƣợc lập lại đến lần thứ 4 thì màu của dịch chiết đã rất nhạt và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy không còn vết nên không tiếp tục chiết lần thứ 5 nữa.
Khối lƣợng cao tổng thu đƣợc là 943,50 g. Hiệu suất điều chế cao tổng:
Cao tổng sau khi đƣợc điều chế xong sẽ đƣợc cho thêm một ít methanol rồi cho vào tủ lạnh để bảo quản tránh sự xâm hại của các vi sinh vật và thực hiện các giai đoạn sau.
3.4.2.2 Điều chế cao phân đoạn từ cao tổng
Bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng cao tổng lần lƣợt với các dung môi hữu cơ ta sẽ thu đƣợc các cao phân đoạn. Trong phạm vi luận văn này, tiến hành điều chế cao PE, cao chloroform và cao Ea. Phần dịch còn lại sau quá trình chiết lỏng – lỏng với các dung môi trên đƣợc lƣu trữ lại có thể không khảo sát hoặc có thể dùng để sắc ký cột pha đảo.
3.4.2.3 Điều chế cao PE
Sử dụng bình lóng 500 mL để chiết lỏng – lỏng. Đầu tiên, ta hòa tan cao tổng khô bằng một lƣợng methanol tối thiểu. Mỗi lần chiết, ta cho vào bình lóng khoảng 50 g cao methanol ở dạng lỏng và cho nƣớc vào tƣơng đƣơng thể tích của 50 g cao trên theo tỉ lệ 1:1. Sau đó, ta cho thêm vào bình lóng từ 200 – 300 mL PE, lắc đều bình để các thành phần trong cao tổng phân bố đều ở hai pha. Để yên bình lóng trên giá khoảng 15 phút cho dung dịch phân lớp. Lấy lớp PE phía trên còn dịch nƣớc phía dƣới tiếp tục chiết với PE, quá trình chiết đƣợc lặp lại nhiều lần đến khi ta thấy lớp PE không màu nữa và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng thấy không còn vết nữa thì kết thúc.
SVTH:Nguyễn Thị Kim Mơ 25
Quá trình chiết trên cũng thực hiện trên lƣợng cao tổng còn lại. Đồng thời, dịch PE đƣợc gom lại, cô quay thu hồi dung môi ta thu đƣợc cao PE. Cao PE sau khi khô hoàn toàn ta thu đƣợc khối lƣợng là 454,37 g.
Hiệu suất chiết cao PE:
3.4.2.4 Điều chế cao chloroform
Dịch nƣớc còn lại sau khi chiết với PE sẽ đƣợc chiết với chloroform. Quá trình chiết với chloroform cũng tƣơng tự nhƣ chiết với PE chỉ khác là do dịch nƣớc sau khi chiết với PE đã có nƣớc rồi ta không cần thêm nƣớc nữa. Do tỉ trọng của chloroform nặng hơn nƣớc nên khi chiết với chloroform ta lấy lớp chloroform ở dƣới, lớp nƣớc ở phía trên sẽ tiếp tục chiết với chloroform đến khi lớp chloroform ở dƣới nhạt màu đồng thời kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng không còn vết gì thì dừng lại.
Phần dịch chloroform (lớp dƣới) sẽ đƣợc gom lại cô quay thu hồi dung môi, ta thu đƣợc cao chloroform. Sau khi cao khô, khối lƣợng cao là 62,13 g.
Hiệu suất điều chế cao chloroform từ cao methanol là:
3.4.2.5 Điều chế cao Ea