ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1 Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Ký sinh trùng thuộc Bộ môn Ký sinh trùng - Khoa Thú y - Tr−ờng Đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
Các x2 Gia Hòa, x2 Gia Phú thuộc huyện Gia Viễn, x2 Phú Sơn, x2 Phú Long thuộc huyện Nho Quan của tỉnh Ninh Bình.
3.1.1 Đặc điểm tự nhiên, kinh tế, xL hội của vùng nghiên cứu
Các đặc điểm tự nhiên, kinh tế, x2 hội đều có ảnh h−ởng trực tiếp và gián tiếp tới sự sinh tr−ởng và phát triển của vật nuôi và của con ng−ời. Các đặc điểm trên cũng ảnh h−ởng trực tiếp và gián tiếp tới sự tồn tại và phát triển của Fasciola spp. Vì vậy để có cơ sở khoa học trong phòng chống Fasciola spp ở vật nuôi và ng−ời thì ta nhất thiết phải tìm hiểu các yếu tố tự nhiên, kinh tế, x2 hội ở vùng nghiên cứu.
3.1.2 Đặc điểm của huyện Gia Viễn
3.1.2.1 Đặc điểm tự nhiên, kinh tế, xF hội
Huyện Gia Viễn là huyện đồng bằng nằm ở phía đông bắc của tỉnh Ninh Bình, phía bắc giáp huyện Thanh Liêm (tỉnh Hà Nam) và huyện Lạc Thủy (Hòa Bình), phía tây nam giáp huyện Nho Quan, phía đông giáp huyện ý Yên (Nam Định) và huyện Hoa L−. Trung tâm huyện cách thành phố Ninh Bình 20km, có mạng l−ới giao thông thuận lợi nên Gia Viễn có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển sản xuất hàng hóa nông nghiệp.
Huyện Gia Viễn có tổng diện tích tự nhiên là 178,5 km², có 1 thị trấn và 20 x2, với dân số 117.356 ng−ời, mật độ dân số là 657 ng−ời/km² chủ yếu là lao động nông nghiệp. Diện tích đất nông nghiệp có 9.218,6 ha trong đó diện tích cấy lúa là 7.737,2 ha, diện tích trồng cây công nghiệp và trồng màu là 429,8 ha, toàn huyện có 111,7 ha diện tích cây ăn quả, 13,3 ha trồng cỏ. Diện tích rừng tự nhiên có 553,9 ha, rừng trồng là 385,6 ha. Diện tích nuôi
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………23
trồng thủy sản có 318,6 ha [39].
Về cơ cấu kinh tế: nông lâm nghiệp chiếm 51,6%, thủy sản chiếm 0,9%, công nghiệp chiếm 5,9%, dịch vụ th−ơng mại là 16,5%..., Giá trị sản xuất nông nghiệp năm 2008 về chăn nuôi là 83.457 triệu đồng, trồng trọt 571.155 triệu đồng, dịch vụ nông nghiệp 5.932 triệu đồng. Sản xuất công nghiệp 75.417 triệu đồng, thủy sản 4.783 triệu đồng, sản l−ợng l−ơng thực cả năm đạt 99.505 tấn [39].
Do nằm ở đồng bằng sông Hồng nên huyện Gia Viễn có khí hậu nhiệt đới gió mùa đặc tr−ng của vùng đồng bằng Bắc Bộ, trong năm có 4 mùa rõ ràng, l−ợng m−a trung bình trong năm từ 1350 - 1650mm, tập trung từ tháng 4 - tháng 9, có nhiệt độ trung bình 23,3°C, độ ẩm trung bình 81 - 87% có hệ thống sông ngòi, ao, hồ, m−ơng máng phong phú [39].
3.1.2.2 Tình hình chăn nuôi và dịch bệnh
Gia Viễn có phong trào chăn nuôi lợn và gia cầm t−ơng đối phát triển, chăn nuôi trâu, bò, dê kém phát triển. Tổng đàn trâu, bò, dê toàn huyện có 36.014 con, trong đó trâu là 10.307 con, bò là 16.486 con và dê là 9.251 con. Thức ăn chủ yếu là thực vật, chăn nuôi theo ph−ơng thức chăn thả ở các bờ ruộng, m−ơng và ven đê là chủ yếu, chuồng trại đảm bảo về kỹ thuật ấm áp mùa đông, thoáng mát mùa hè. Đội ngũ cán bộ thú y địa ph−ơng năng nổ nhiệt tình trong công việc, công tác tiêm phòng cũng đ−ợc chú ý, quan tâm. Tuy nhiên có nhiều yếu tố làm cho dịch bệnh vẫn ảnh h−ởng đến sinh tr−ởng và phát triển của vật nuôi.
3.1.3 Đặc điểm của huyện Nho Quan
3.1.3.1 Đặc điểm tự nhiên, kinh tế, xF hội
Nho Quan là một tỉnh miền núi nằm phía tây bắc của tỉnh Ninh Bình, phía bắc giáp tỉnh Hòa Bình, phía nam giáp thị x2 Tam Điệp, phía đông giáp huyện Gia Viễn, phía tây giáp tỉnh Thanh Hóa. Tổng diện tích tự nhiên của huyện là 45.828,6 ha, trong đó diện tích đất nông nghiệp là 15.361,3 ha, diện tích đất lâm nghiệp là 14.295,97 ha. Huyện có 1 thị trấn và 26 x2 đều đ−ợc nhà n−ớc công nhận là x2, thị trấn miền núi trong đó có 3 x2 vùng cao là Kỳ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………24
Phú, Phú Long, Cúc Ph−ơng. Đất đai Nho Quan đ−ợc chia thành 3 vùng khá rõ ràng vùng núi, vùng bán sơn địa và vùng đồng bằng chiêm trũng, mỗi vùng đều có thế mạnh riêng về chăn nuôi và trồng trọt [39].
Kinh tế bình quân thu nhập trên đầu ng−ời đạt trên 1,5 triệu đồng/năm. Tốc độ tăng tr−ởng trên 9%/năm. Tỷ trọng nông, lâm, ng− nghiệp chiếm 71,42%, công nghiệp, xây dựng chiếm 8%, dịch vụ chiến 20,58% [39].
Nho Quan là huyện miền núi nh−ng có hệ thống giao thông đ−ờng bộ, thuận lợi, hệ thống các công trình thuỷ lợi nội đồng đ−ợc huyện và tỉnh quan tâm nên đ−ợc bê tông hoá và do huyện có rừng nguyên sinh quốc gia Cúc Ph−ơng nên có hệ sinh thái động thực vật phong phú. Nho Quan còn nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung bình trong năm là 23ºC, l−ợng m−a trung bình là 1.460mm, độ ẩm trung bình là 81% [39].
3.1.3.2 Tình hình chăn nuôi và dịch bệnh
Nho Quan là huyện miền núi nh−ng có phong trào chăn nuôi t−ơng đối phát triển. Tổng đàn trâu, bò, dê của huyện có 14.080 con, trong đó có 1342 con trâu, 6923 con bò, 5815 con dê, ph−ơng thức chăn nuôi chủ yếu chăn thả tự do ở ven s−ờn đồi, ven đê.
Đàn gia súc phát triển tốt ít dịch bệnh, công tác phòng trừ tốt, đội ngũ thú y địa ph−ơng phát triển. Bên cạnh đó vẫn tồn tại 1 số vấn đề cần quan tâm nh− cơ sở vật chất cho thú y còn nghèo nàn, tỷ lệ tiêm phòng còn thấp.
3.2 Thời gian nghiên cứu
- Đề tài đ−ợc tiến hành từ tháng 10 năm 2008 đến tháng 06 năm 2009. 3.3 Đối t−ợng nghiên cứu
Nghiên cứu trên trâu, bò, dê và ng−ời, các loại rau thuỷ sinh và ốc n−ớc ngọt, sán lá gan lớn Fasciola spp.
- Trâu, bò đ−ợc chia làm 3 độ tuổi: từ 1 - 3 năm, từ 4 - 8 năm, trên 8 năm. - Dê đ−ợc chia làm 2 độ tuổi: nhỏ hơn 1 năm và lớn hơn 1 năm.
- Ng−ời.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………25
- Các loại rau thuỷ sinh làm thức ăn cho trâu, bò, dê và thức ăn sống cho ng−ời (rau ngổ, rau muống).
- Sán lá gan lớn Fasciola spp. 3.4 Nguyên liệu nghiên cứu
- Phân trâu, bò, dê các lứa tuổi ở các địa điểm nghiên cứu. - Gan, túi mật, ống mật trâu, bò, dê ở các địa điểm nghiên cứu. - Trứng Fasciola gigantica.
- Rau muống, rau ngổ ở các địa điểm nghiên cứu. 3.5 Dụng cụ nghiên cứu
- Kính hiển vi quang học, máy ly tâm, tủ lạnh.
- Đĩa lồng, phiến kính, lọ tiêu bản, dao mổ, phanh kẹp, đũa thủy tinh, cốc nhựa, cốc ly tâm, vòng vớt, l−ới lọc, găng tay, túi nilon, khay men…..
- Hoá chất. + formon 5%: 500 – 1000ml. + NaOH 0,01N: 100ml. + Axit axetic 0,01N: 100ml. + N−ớc cất: 2000 – 3000ml. + Glyxerin 30%: 100 – 200ml. + Cồn etylic 70º: 100ml. + Xanh Methylen: 100 – 200ml. Và các hoá chất cần thiết khác.
3.6 Nội dung nghiên cứu
3.6.1 Đặc điểm dịch tễ học của Fasciola spp ở trâu, bò, dê, ng−ời
3.6.1.1 Thành phần loài Fasciola spp ở trâu, bò, dê tại địa điểm nghiên cứu. 3.6.1.2 Tỷ lệ và c−ờng độ nhiễm Fasciola spp dê qua mổ khám.
3.6.1.3 Tỷ lệ và c−ờng độ nhiễm Fasciola spp qua xét nghiệm phân.
3.6.1.4 Tỷ lệ nhiễm Fasciola spp trên trâu, bò, dê ở các lứa tuổi theo ph−ơng pháp xét nghiệm phân.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………26
3.6.1.6 Khảo sát tình hình và mức độ sử dụng rau thủy sinh dùng làm thức ăn sống ở ng−ời.
3.6.1.7 Tìm hiểu tình hình nhiễn Adolescaria của Fasciola spp ở một số rau thủy sinh th−ờng đ−ợc ng−ời dùng làm thức ăn sống.
3.6.1.8 Tìm hiểu tình hình ng−ời nhiễm Fasciola spp ở vùng nghiên cứu.
3.6.2 Một số đặc điểm sinh học của Fasciola spp
3.6.2.1 Các giai đoạn phát triển của mầm bệnh Fasciola spp ở ngoại cảnh 3.6.2.2 Các giai đoạn phát triển của mầm bệnh Fasciola spp trong vật chủ trung gian
3.6.3 Đề xuất biện pháp phòng trừ bệnh
3.7 Ph−ơng pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm
3.7.1 Ph−ơng pháp nghiên cứu
Để thực hiện nghiên cứu đề tài, chúng tôi đ2 sử dụng các ph−ơng pháp nghiên cứu ký sinh trùng th−ờng quy hiện đang đ−ợc áp dụng ở các phòng thí nghiệm ký sinh trùng ở các tr−ờng đại học trong n−ớc và trên thế giới.
Chúng tôi chọn địa điểm nghiên cứu theo ph−ơng pháp chọn mẫu ngẫu nhiên đơn giản, ph−ơng pháp lấy mẫu chùm và lấy mẫu phân tầng [16].
Điều tra tỷ lệ nhiễm Fasciola spp theo ph−ơng pháp nghiên cứu cắt ngang.
3.7.1.1 Ph−ơng pháp nuôi ốc Limnaea viridis
- Thu thập ốc: Dùng ph−ơng pháp thủ công (bắt bằng tay) ốc Limnaea viridis th−ờng phân bố ở những ruộng mạ xâm xấp n−ớc, r2nh m−ơng cạn, chúng th−ờng bò d−ới mặt đất hoặc nổi trên mặt n−ớc, hay bám vào các cây thuỷ sinh nổi trên mặt n−ớc, những cây chìm d−ới n−ớc.
- Kỹ thuật nuôi ốc: Những con ốc đ−ợc chọn nuôi là những con to khoẻ, nguyên vẹn về hình dáng. ốc đ−ợc nuôi trong bể nuôi có đ−ờng kính 30cm, chiều cao 35cm, dung tích từ 5 – 7 lít n−ớc, đáy bể có phủ một lớp cát sông hay một lớp đất ruộng lúa đ2 sấy khô dày 3 – 4cm. N−ớc dùng nuôi ốc là n−ớc máy có độ pH = 7,2. Trong bể nuôi làm những đảo đất nhân tạo nhô lên khỏi mặt n−ớc khoảng 3 – 4cm, thả vào bể nuôi một ít cây thuỷ sinh, hàng ngày thêm thức
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………27
ăn cho ốc. Thức ăn thích hợp cho ốc là rau xà lách, mỡ bò... Luôn luôn đảm bảo đủ thức ăn cho ốc, hai đến ba ngày thay n−ớc một lần để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho ốc [20].
Để tạo đ−ợc ốc thuần khiết, sau mỗi lần ốc mẹ đẻ chúng tôi lại chuyển ốc con sang bể nuôi khác.
3.7.1.2 Ph−ơng pháp nuôi trứng sán
- Thu thập trứng Fasciola spp bằng hai cách: dội rửa dịch mật của trâu, bò dê bị mắc sán lá gan và mổ tử cung của sán lá gan loài Fasciola spp tr−ởng thành [20].
+ Thu thập trứng bằng ph−ơng pháp dội rửa dịch mật: lấy túi mật của trâu, bò, dê bị nhiễm sán lá gan loài Fasciola gigantica, cắt túi mật để dịch mật chảy ra và rửa cả túi mật vào cốc có chứa n−ớc máy, gắp hết sán và dội rửa liên tục nhiều lần sau đó gạn bỏ lớp n−ớc trong trên cốc đi giữ lại trứng ở phần đáy cốc.
+ Thu thập trứng bằng ph−ơng pháp mổ tử cung sán tr−ởng thành: thu thập sán tr−ởng thành ở ống dẫn mật, túi mật sau đó tiến hành mổ phần tử cung nằm ngay sau giác miệng đ−ợc dầm nhẹ bằng đũa thuỷ tinh sau đó cho hết vào cốc sạch chứa n−ớc, sau đó lọc qua phễu lọc sang cốc khác, để lắng cặn 10 - 15 phút gạn bỏ lớp n−ớc trong phía trên giữ lại cặn và làm nh− vậy nhiều lần đến khi hết mảnh thịt sán thì giữ lại cặn đổ ra đĩa lồng kiểm tra d−ới kính hiển vi.
- Ph−ơng pháp nuôi trứng sán: Sau khi thu thập đ−ợc trứng đem nuôi trứng ở các đĩa lồng có đ−ờng kính 10cm trong môi tr−ờng n−ớc máy có độ pH = 7,2 với số l−ợng nuôi khoảng 300 trứng/1 đĩa lồng, gạn rửa thay n−ớc 2 ngày 1 lần.
- Cách đếm mật độ trứng sán: Đếm bằng ph−ơng pháp đặt sợi tóc, tạo thành các ô nhỏ hình tam giác trong đĩa lồng, tiến hành đếm trứng từng ô và tính đ−ợc tổng số trứng thu đ−ợc.
3.7.1.3 Ph−ơng pháp đo kích th−ớc trứng và ấu trùng bằng trắc vi thị kính
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………28
ph−ơng pháp trắc vi thị kính thì ấu trùng tr−ớc khi đo phải đ−ợc hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để ấu trùng bất động mà không làm thay đổi kích th−ớc và hình thái của chúng.
Cách sử dụng: Tháo thấu kính mắt của thị kính ra và đặt th−ớc đo thị kính vào gờ chắn bên trong thị kính rồi lắp thấu kính lại. Đặt tiêu bản lên bàn kính điều chỉnh tiêu cự cho rõ đối t−ợng cần quan sát, xác định vạch trên th−ớc đo t−ơng ứng với chiều dài và chiều rộng của ấu trùng ở độ phóng đại của kính hiển vi, kết quả tin cậy phải đo từ 30 ấu trùng trở lên.
Muốn xác định giá trị của mỗi vạch trên th−ớc đo thị kính đối với độ phóng đại này ta cần tính để chuyển ra àm thì ta phải sử dụng th−ớc đo vật kính. Th−ớc đo vật kính là một bản kim loại có một lỗ nhỏ chính giữa trong đó có tấm kính là th−ớc đo có chiều dài là 1mm và đ−ợc chia chính xác thành 100 phần, mỗi phần là 0,01mm t−ơng ứng với 10àm [20].
3.7.1.4 Ph−ơng pháp lấy mẫu phân trâu, bò, dê
- Phân trâu, bò, dê lấy để dùng làm xét nghiệm cần phải đảm bảo chính xác đúng con vật để chẩn đoán, phân xét nghiệm phải còn mới, còn t−ơi và có lý lịch rõ ràng. Để lấy phân xét nghiệm chúng tôi đến tận các gia đình nuôi trâu, bò, dê vào sáng sớm để lấy trực tiếp ngay tại chuồng nuôi để tránh nhầm lẫn với con khác. Riêng với dê do phân ở dạng viên lại đ−ợc nhốt chung vào ô chuồng nên lấy phân ngay ở nền chuồng sẽ không đảm bảo độ chính xác vì vậy cần phải lấy trực tiếp ở hậu môn, do dê có đặc tính thải phân khi bị kích thích vào hậu môn nên chúng tôi lấy phân dê đủ tiêu chuẩn.
Mỗi mẫu phân lấy khoảng 10 - 15g đ−ợc cho vào túi nilon sạch, bên ngoài mỗi túi đ−ợc ghi chép đầy đủ thông tin về chủ gia súc, địa chỉ, lứa tuổi, khối l−ợng, tính biệt. Tất cả những thông tin trên đều đ−ợc ghi chép đầy đủ vào sổ theo dõi, các mẫu phân lấy đ−ợc đều mang xét nghiệm ngay. Nếu mẫu nào ch−a đ−ợc xét nghiệm ngay thì cần phải bảo quản bằng cách cho vài giọt Formalin 1% để trong tủ lạnh d−ới 10°C.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………29
3.7.1.5 Xét nghiệm trứng Fasciola spp bằng ph−ơng pháp gạn rửa sa lắng
- Nguyên lý. Lợi dụng sự chênh lệch tỷ trọng giữa n−ớc sạch và trứng sán để phân ly trứng ra khỏi phân.
- Cách tiến hành: Lấy 5 - 10 g phân (đối với phân dê lấy khoảng 4 - 8 viên phân) cho vào cốc nhựa có thể tích là 200ml, sau đó đổ n−ớc sạch vào cho đến gần đầy cốc, dùng đũa thủy tinh khuấy cho tan phân, sau đó dung dịch phân đ−ợc lọc qua l−ới sắt có mắt l−ới từ 0,5 - 1 mm, bỏ b2 trên l−ới đi. dung dịch n−ớc phân lọc qua đ−ợc để yên khoảng 5 phút cho lắng cặn, sau đó đổ n−ớc trong ở phía trên đi lấy cặn ở d−ới rồi cho thêm n−ớc sạch vào cho tới gần đầy cốc, tiếp tục lắng cặn, lặp đi lặp lại 3 - 5 lần, tới khi n−ớc ở trên trong cặn ở đáy còn ít và sạch. Cuối cùng lấy cặn đổ ra đĩa lồng và soi d−ới kính hiển vi quang học để tìm trứng sán. Trứng sán có mầu vàng chanh chín.
3.7.1.6 Cách thu thập sán tr−ởng thành theo ph−ơng pháp mổ khám không toàn diện của K.I.Skijiabin
- Tìm sán tr−ởng thành bằng cách mổ khám, mổ ống dẫn mật của gan và các bộ phận khác của trâu, bò, dê tại các cơ sở giết mổ trâu, bò, dê. Sán tìm