3.1.1.2.Kiểm nghiệm, xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu
3.5.7. Phương pháp thử tác dụng kháng khuẩn [12]:
khuẩn [12]:
Phương pháp thử: phương pháp pha lỗng được sử dụng để xác định MIC của các chất kháng khuẩn, đây là cơ sở để đánh giá mức độ hoạt tính kháng khuẩn.
Mơi trường:
+ Mơi trường hoạt hĩa vi khuẩn: Tryptic Soy Broth (TSB) + Mơi trường thử nghiệm: Thạch Mueller – Hinton (MHA) Chuẩn độ đục:sử dụng thang độ đục McFarland 0,5
• Thang chuẩn độ đục McFarland 0,5:
Mẫu cấy phải được điều chỉnh độ đục cho bằng với McFarland 0,5 bằng cách pha lỗng với nước muối sinh lý hoặc bằng canh thang Mueller – Hinton hoặc TSB. Độ đục này tương đương với mật độ vi khuẩn 1-2.108 CFU/ml. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm:Thực hiện theo phương
pháp tăng sinh, đối với MRSA dùng pp lấy khĩm trực tiếp để tạo huyền dịch cĩ độ đục cần thiết.
• Phương pháp tăng sinh: Vi khuẩn thử nghiệm được cấy vào ống nghiệm chứa 4-5ml mơi trường TSB, ủ
ở 35oC cho đến khi cĩ độ đục bằng hoặc vượt quá MeFarland 0,5.
Đối với phương pháp pha lỗng trong thạch, huyền trọc vi khuẩn trên được pha lỗng tiếp 10 lần để cĩ mật độ vi khuẩn khoảng 107 CFU/ml. Khi đĩ nếu ta chấm 1 vết khoảng 1-2ml sẽ cĩ số lượng vi khuẩn 104CFU/vết.Vi khuẩn sau khi đã điều chỉnh phải được sử dụng trong vịng 15 phút. • Chủng vi khuẩn sử dụng: 1. Streptococus faccalis. 2. Staphylococus aureus. 3. E. coli 4. Pseudomonas auruginosa
5. MRSA (Staphylocoais aureus kháng Methicilin)
Chuẩn bị giải nồng độ chất thử:Chất thử nghiệm được cân chính xác và pha thành dung dịch me trong dung mơi thích hợp, khi sử dụng pha lỗng bằng mơi trường thử nghiệm sao cho tạo thành giai nồng độ trong mơi trường thử nghiệm (cĩ nồng độ sau bằng ½ nồng độ trước). Khoảng nồng độ cần pha tùy thuộc vào MIC dự đốn của chất thử.Chất thử nghiệm được trộn vào mơi trường thạch đã nấu chảy và để nguội 48-50oC, lắc đều, đổ vào hộp petri và để cho thạch đơng lại.
Tiến hành cấy vi khuẩn:Dùng dụng cụ thích hợp (đầu cấy hoặc micropipet) cấy 1-2pul huyền trọc vi khuẩn đã điều chỉnh ở trên lên bề mặt mơi trường thạch cĩ chứa các nồng độ chất thử. Bắt đầu cấy từ nồng độ thấp nhất.
Song song tiến hành một hộp chứng khơng chứa chất thử.
Để yên khoảng 15 phút để vết chấm khơ. Lật ngược hộp thạch đã cấy và ủ trong tủ ấm ở 35-37oC trong 16-18 giờ. Đối với MRSA phải ủ trong vịng 24h.
Đọc kết quả:Kết quả chỉ cĩ giá trị khi vi khuẩn trong mẫu chứng mọc bình thường.Đặt hộp thạch trên một bề mặt sẫm màu, khơng phản xạ ánh sáng, quan sát sự tạo thành khĩm của vi khuẩn thử nghiệm. Tìm hộp cĩ nồng độ thấp nhất ức chế hồn tồn sự tạo khĩm, nồng độ của hộp này làm MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm.