Chiết dịch enzyme
Thu enzyme từ môi trường nuôi cấy đặc: cân 5 g mẫu sinh khối nghiên cứu, nghiền nhỏ, cho vào bình nón có sẵn 70 ml nước. Để vào tủ ấm 30ºC trong 30 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Định mức đến vạch, lắc đều, lọc. Dịch trong thu được là enzyme thô để dùng cho các thí nghiệm [10].Thu enzyme từ môi trường lỏng: lọc bỏ sinh khối hoặc ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 15 phút, chiết rút lấy dịch trong thì thu được enzyme thô.
Phương pháp khuếch tán trên thạch
Chuẩn bị môi trường cơ chất + thạch (pH = 7,0 – 7,2) gồm 20 g thạch agar + 2 g CMC (hoặc 2 g bột cellulose) trong 1000 ml nước. Thanh trùng ở 1atm trong 30 phút. Đổ môi trường vào các hộp petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3mm. Dùng khoan nút chai đục lỗ (d = 10 mm) trên lớp thạch cách nhau 40 mm. Nhỏ 0,2 ml dịch enzyme cần thử và 0,2 ml H2O làm đối chứng, để trong tủ lạnh 4ºC khoảng 4 giờ, sau đó đặt vào tủ ấm 30ºC trong 24 giờ.
Hoạt tính enzyme được xác định bằng giá trị D – d (mm) sau khi nhuộm màu bằng thuốc thử lugol. Vùng CMC (hay glucose) bị phân giải không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch [10].
Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme
Cấy xạ khuẩn vào môi trường Gause I trong ống nghiệm (5ml/ống), đặt trên máy lắc 160 vòng/phút khoảng 24 giờ. Sau đó dùng pipet đưa 0,5 ml dịch nuôi cấy vào lần lượt 6 ống nghiệm đựng sẵn 5 ml môi trường Gause I. Cứ sau 24 giờ thu được enzyme và xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp khuếch tán trên thạch. Kết quả đánh giá dựa vào kích thước vòng phân giải (D – d, mm) [7].
Phương pháp xác định pH thích hợp
Xạ khuẩn được cấy vào môi trường ISP – 1 đã chỉnh pH từ 3 – 10. Nuôi ở nhiệt độ 280C và 370C. Sau 7 - 10 ngày lấy ra quan sát sự sinh trưởng [12].