Vật liệu và phương pháp cố định là hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả của quy trình cố định enzym. Trong đó, đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định là cơ sở cho sự chọn lựa phương pháp cố định enzym. Không có vật liệu cố định nào thích hợp cho tất cả các loại vật liệu cố định và cũng không có enzym nào thích hợp cho tất cả cá loại vật liệu cố định.
1.3.6.1. Yêu cầu của chất mang cố định enzym [15]
Chất mang lý tưởng sử dụng để cố định enzym điều trước tiên phải rẻ. Điều này có liên quan đến hiệu quả kinh tế của quy trình công nghệ, đặc biệt có ý nghĩa khi quy trình đó được áp dụng ở quy mô công nghiệp.
Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định. Nhờ đó chất mang mới chịu được các điều kiện của môi trường như khuấy trộn, áp lực trong các quy trình sản xuất.
Chất mang phải bền vững về mặt hóa học, không tan trong môi trường phản ứng.
Chất mang phải bền vững với sự tấn công của các vi sinh vật khác.
Chất mang phải có độ trương nở lớn (độ trương nở là khả năng chất mang hút nước và trương lên), diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Tính chất này vừa làm cho chất mang tăng khả năng cố định enzym, vừa làm tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzym cố định trong chất mang.
Chất mang sử dụng trong kỉ thuật cố định enzym làm tăng số lần tái sử dụng của enzym.
1.3.6.2. Phân loại [15, 21]
Vật liệu cố định enzym và tế bào có thể chia làm hai loại vật liệu vô cơ và vật liệu hữu cơ.
Vật liệu vô cơ
Vật liệu vô cơ thường rất bền với môi trường xung quanh, có cầu tạo dạng xốp, nhiều lỗ nên dễ hấp phụ enzym. Đây là loại vật liệu bền, rẻ tiền và dể kiếm.
Tuy nhiên, vật liệu vô cơ thường chỉ hấp thụ tốt enzym đối với phương pháp vật lý, với phương pháp hóa học thì khó khăn hơn do ít các gốc hoạt động nên khó gắn. Các vật liệu vô cơ thông dụng như thủy tinh xốp, các oxit kim loại như oxit mangan, oxit magie, oxit titan, aluminum oxide. . .
Ví dụ nhôm oxide Al2O3 có cấu tạo xốp, trơ về mặt hóa học, các phân tử nhỏ và mịn nên dễ dàng hấp phụ các enzym khi ta cố định. Đây là một trong những vật liệu đầu tiên được sử dụng trong cố định enzym.
Vật liệu hữu cơ
Vật liệu hữu cơ dùng làm chất mang cố định enzym được chia làm hai loại: polymer sinh học và polymer tổng hợp hóa học. Chúng thường có các nhóm hoạt động hóa học như: -NH2 – COOH, -OH, -SH. . . nên dễ kết gắn với enzym.
- Chất mang là polymer tự nhiên:
· Ưu điểm của polymer sinh học có tính tương thích sinh học cao với enzym và có thể phân hủy sinh học nhờ vi sinh vật. Nhưng nhược điểm của nó là độ bền với tác động môi trường không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công. · Polyscaccharide là nhóm chất mang đang thịnh hành và được sử
dụng rộng rãi nhất hiện nay, đó là cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng. Ở mỗi loại có những đặc điểm, tính chất khác nhau, tùy theo mục đích sử dụng và đối tượng nghiên cứu mà có sự lựa chọn thích hợp .
· Chất mang là protein (gelatin, keratin, albumin, . . .) dễ tạo màng và tạo hạt, có nhóm chức năng là nhóm - NH2. Vì vậy thường được sử dụng nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân khâu mạch là glutaraldehyde.
- Chất mang là polymer tổng hợp hóa học: Số lượng của nhóm này khá phong phú: polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polvinylacetate, polyacrylic, polystyren, polyethylen ghép với vinyl monomer…Ưu điểm của nhóm này là bền, có tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương nở tốt, một số polymer có thể điều chỉnh được kích thước siêu lỗ. Nhược điểm là giá thành cao (polyacrylic, polyacrylamide. . .) khả năng tương hợp sinh học kém, gây ô nhiễm môi trường do quá bền vững, không phân hủy trong tự nhiên.
Hiện nay, xu hướng chung là ghép các vật liệu polymer tự nhiên với các polymer tổng hợp để cải thiện tính chất cơ lý. Nhiề vật liệu copolymer đã được thương mại hóa như ultrogel là copolymer của agarose với polyacrylaminde, cellulose được ghép với polyacylamide. . .
1.3.6.3. Chất mang sử dụng trong nghiên cứu Eupergit C [3]
Eupergit C là các hạt có kích thước lỗ lớn với đường kính từ100 đến 250 µm, là copolymer của N,N-methylene-bis-meth- acrylamide, glycidyl methacrylate, allyl glycidyl hoặc methacrylamide
Eupergit C có thể liên kết với nhóm NH2 của protein thông qua nhóm oxirane ở pH trung tính hoặc pH kiềm. Eupergit C cũng có thể liên kết với phân tử enzyme thông qua liên kết với nhóm sulfhydril và nhóm carboxyl trong pH acid, trung tính và kiềm. Đo đó, eupergit C ó thể tạo liên kết cộng hóa trị với enzyme từ pH 1 cho đến pH 12, điều đó có nghĩa là nó có thể liên kết với enzyme tại pH mà enzyme ổn định và không mất hoạt tính. Dựa vào hàm lượng nhóm oxirane trên bề mặt của Eupergit C ( khoảng 600µmol/g Eupergit C khô), enzyme có thể cố định lên nhiều vị trí khác nhau trên bề mặt của Eupergit C, hiện tượng này gọi là chất đa điểm gắn kết ‘‘multi-point-attachment”, và điều này đươc xem như là một nhân tố giúp cho enzyme cố định lên chất mang ổn định hơn.
Eupergit C là một chất mang đã được thương mại hóa và được sử dụng rộng rãi trên thế giới, hàng năm một lượng khoảng vài tấn được sử dụng để sản xuất enzyme cố định.
Sepharose [2]
Q-sepharose và SP-sepharose là những chất mang dạng hạt trao đổi ion. Chúng dựa trên sự bền và chặt trong liên kết chéo của agarose. Có đường kính trung bình khoảng 34 µm. với tính chất bền về lý hóa học chúng được sử dụng nghiên cứu ứng dụng nhiều trên nhiều lĩnh vực nhất là việc cốđịnh enzyme.
Bảng 1.6. Một số tính chất của sepharose
Loại ion trao đổi Trao đổi anion (Q), trao đổi cation (SP) Khả năng ion hóa (mmol/ml
gel) 0,15 – 0,20
Thành phần gel 6% agarose liên kết chéo
Đường kính (µm) 24 - 44
Độ bền hóa học
Sử dụng với tất cả các loạiđệm thông thường Urea 8M
Guanidine hydrochloride 6 M Ethanol 70%
Chịuđược pH 2-12 (Q), 4-13 (SP) Áp suất chịuđược 0,5 MPa (5 bar, 7 psi)
Bảo quãn Ethanol 20% (Q), ethanol 20% trong 0,2M natri acetate (SP
Chitosan
Chitosan là một dẫn xuất của chitin được acyl hóa trong dung dịch kiềm đặc, chitosan có cấu tạo 2-amino-2-deoxy-b-D-glucose.Chitosan là một polymer sinh học có khối lượng phân tử lớn (100.000 – 1.200.000 Da), khối lượng phân tử của nó phụ thuộc vào nguồn gốc, phương pháp tạo ra nó.
Chitosan tan trong các dung dịch acid loãng có pH<6, có thể hòa tan trong acid hữu cơ, ít tan trong acid vô cơ. Tại pH 7 chitosan ổn định nhưng pH>7 tính ổđịnh giảm xuống và có khả năng tạo gel
Khi cố định enzyme lên chitosan người ta thường dùng glutaraldehid để làm chất hoạt hóa. Glutaraldehyde liên kết với chitosan thông qua liên kết cộng hóa trị giữa nhóm –NH2 và nhóm –CHO của glutaraldehyde, sau đó hỗn hộp này sẽ liên kết với enzyme bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm –NH2 của enzyme và nhóm –CHO của glutaraldehyde.