Mục đích cuối cùng của việc cố định enzym là gắn được enzym lên chất mang nào đó để ta có thể thực hiện phản ứng enzym nhiều lần. Công việc này cần thực hiện các bước sau:
- Chọn chất mang phù hợp với enzym cần gắn vào nó. - Hoạt hoá chất mang cho khả năng gắn tốt hơn.
Phân loại
Dựa vào bản chất các liên kết tạo thành giữa chất mang và enzym, người ta chia thành ba phương pháp cố định enzym:
- Phương pháp vật lí: Dựa vào các liên kết vật lí như liên kết ion, liên kết kị nước, liên kết hydro, liên kết tĩnh điện, các quá trình hấp phụ vật lí khác. Những phương pháp này đơn giản khi kết gắn nhưng độ bền của việc kết gắn enzym và chất mang không cao, có thể bị tách ra một phần trong phản ứng khi điều kiện nhiệt độ, pH, các điều kiện khác biến động.
- Phương pháp hóa học: Nhờ vào liên kết đồng hóa trị giữa enzym và chất mang.
- Phương pháp bao enzym trong khuôn gel: Đính enzym vào trong khuôn gel có kích thước lỗ khá nhỏ đủ để giữ enzym, còn để cho các chất khác qua lại tự do.
1.3.5.1. Phương pháp vật lí
Phương pháp hấp phụ lí học được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt trong giai đoạn đầu của việc nghiên cứu enzym không tan.
Quy trình thực hiện phương pháp khác đơn giản: chất hấp phụ và enzym được trộn lẫn vào nhau, ủ trong một khoảng thời gian cho phép rồi lọc, rửa phần enzym không hấp phụ. Sự hấp phụ xảy ra nhờ tương tác của các liên kết ion, kỵ nước, hydrogen và lực Van der Waals …
- Chất mang dùng trong phương pháp này có thể có các đặc điểm khác nhau.
- Chất mang không có lỗ xốp, enzym sẽ được gắn vào theo từng lớp trên bề mặt chất mang.
- Chất mang có lỗ xốp, enzym sẽ xâm nhập vào các lỗ xốp.
- Chất mang tĩnh điện sẽ tạo thành các liên kết ion giữa chất mang và enzym.
- Phương pháp hấp phụ vật lý không đòi hỏi việc sử dụng hóa chất phản ứng đặc biệt và các bước thực hiện không phức tạp.
- Điều kiện thực hiện cũng đơn giản và nhẹ nhàng có thể ứng dụng để cố định nhiều loại enzym.
- Phương pháp này ít gây hưởng đến enzym so với các phương pháp hoá học khác vì việc gắn kết chủ yếu dựa vào lực liên kết hydro, lực Vander Waals. . .
- Họat tính enzym cố định thường cao, từ 50% đến 100%
- Nếu xác định được chất mang phù hợp thì phương pháp này kính tế và đơn giản nhất.
- Dễ chế tạo ở dạng hạt để tạo cột phản ứng.
Nhược điểm: lực liên kết giữa enzym và chất mang trong phương pháp hấp phụ vật lý là liên kết không bền nên enzym dễ tách khỏi chất mang khi có tác động cơ học hoặc do tác động của điều kiện môi trường.
Chất mang thường sử dụng là silicagel, thuỷ tinh, polystirol, celluose và các dẫn xuất của cellulose.
1.3.5.2. Phương pháp hoá học
Cố định enzym bằng liên kết cộng hoá trị với các polymer đã được hoạt hoá là một trong những phương pháp cố định enzym phổ biến nhất, đảm bảo liên kết vững chắc của enzym với chất mang.
Điều kiện cơ bản để gắn enzym vào chất mang không hoà tan hoặc gắn các phân tử enzym riêng biệt vào nhau bằng liên kết cộng hoá trị là làm thế nào để các nhóm thể hiện hoạt tính của enzym không bị tham gia vào phản ứng.
Phản ứng phải tiến hành trong điều kiện nhẹ nhàng, không làm biến tính enzym. Có hai cách để cố định enzym.
- Liên kết trực tiếp: Nối đồng hoá trị liên kết các phân tử enzym riêng biệt thành một liên hợp cao phân tử không hoà tan. Để điều chế các enzym cố định loại này người ta thường dùng các tác nhân lưỡng chức như bisdiazo-benzidin, bisdiazobenzidin 2.2 –disulfua acid và một số
hợp chất khác, đặc biệt hay sử dụng aldehyd glutaric làm tác nhân để liên kết các phân tử protein- enzym. Điều kiện phản ứng là trị số pH thích hợp sao cho tại đó phân tử enzym mang ít điện tích nhất.
- Liên kết gián tiếp: Kết hợp phân tử enzym với chất mang thông qua một chất trung gian (chất hoạt hóa). Quá trình kết hợp enzym có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu chất mang có chứa các nhóm có khả năng tham gia tương tác trực tiếp với nhóm amin của protein – enzym.
Enzyme Chất
hoạt hóa
chất mang
Phản ứng gồm 2 giai đoạn
- Giai đoạn đầu hoạt hoá chất mang bằng cách đưa vào nhóm có khả năng phản ứng
Chất hoạt hóa Chất mang Chất mang hoạt hóa
- Giai đoạn thứ hai là giai đoạn kết hợp enzym
Enzyme Chất mang hoạt hóa Enzyme không tan
Thông thường các chất hoạt hoá gồm hai nhóm chức, hai đầu phân tử tương tự nhau để khi phản ứng, một nhóm tác dụng với enzym, một nhóm tác dụng với chất mang. Ví dụ: glutaraldehyd CHO-(CH2)3CHO
Người ta thường dùng một số phương pháp sau để hoạt chất mang.
- Hoạt hoá chất mang bằng glutaraldehyde: dùng để hoạt hoá các chất mang có chứa nhóm amime như polyacrylamide, aminoethyl cellulose, chitin, chitosan.
N =CH(CH2)3CH =N–E NH2 + OHC (CH2)3 –CHO + H2N–E
Vật liệu cố định
Glutaraldehyde Enzyme Enzyme cố định
Hoạt hóa bằng phản ứng diazo: Hoạt hóa những chất mang có chứa nhóm amin vòng như polystryren, aminobenzen cellulose
NH2 NaNO2/HCl N2+Cl- N=N-E NH2 NaNO2/HCl N2+Cl- N=N-E H2N-E NH2Cl
- Họat hoá chất mang bằng cyanogenhologenur chất hoạt hoá này thường dùng cho các chất mang có chứa nhóm –OH như các polysaccharide (cellulose, dextran. Agarose).
- Hoạt hóa chất mang bằng phương pháp azit: dùng để hoạt hoá chất mang có chứa nhóm – COOH như carboxymenthylcelluose. Giá thể được chuyển hoá thành dẫn xuất methylester, sau đó chuyển hoá thành hydrazit khi phản ứng với hydrazit , và cuối cùng là azit phản ứng với enzym ở điều kiện nhiệt độ 0oC – 5oC, ph – 7,8
Dẫn xuất azit Enzyme cố định
- Hoạt hóa chất mang bằng carbodiimide: dùng để hoạt hóa chất mang có chứa nhóm –COOH. Khi có mặt N, N-dicylohexlcarbodiimide, enzym dễ dàng liên kết cộng hoá trị với chất mang. Phản ứng xảy ra
ở môi trường acid yếu (pH=5). Đây là phương pháp cố định enzym phản ứng môi trường acid như: aylase, pepsin, cellulose.
CO-NH-E + Vật liệu cố định Dicyclohexylure Enzym Enzym cố định N=C=N + H2N-E NH-CO-NH COOH + N,N-dicyclohexycarbodiimit
- Hoạt hoá chất mang bằng phương pháp alkyl hoá: nhóm halogen trên vật liệu cố định dễ dàng phản ứng với nhóm amino, nhóm sulfihydryl của enzym. Những chất mang halogen acetyl cellulose có thể hoạt hoá theo phương pháp này.
- Hoạt hóa bằng andydride kép: Các chất mang có chứa nhóm carboxyl có thể hoạt hóa bằng phương pháp anhydrid kép. Cho chất mang tác dụng với PCl5. Chất mang đã được hoạt hóa dễ dàng kết hợp với enzym.
- Hoạt hóa bằng phương pháp isocyanat hoặc isothyocyanat: Sử dụng đối với các chất mang có chứa nhóm amin bằng cách cho tác dụng với photgen hoặc thiophotgen để tạo thành dẫn xuất iznocynat hoặc izsothyocyanat. Các nhóm này ở pH trung tính sẽ liên kết với gốc N – cuối và nhóm amin của enzym. Các dẫn xuất của enzym không tan như trypsin, chymotrypsin, glucoamylase được điều chế bằng phương pháp này.
1.3.5.3. Phương pháp nhốt enzym trong khuôn gel
Đây cũng là một phương pháp cố định đơn giản, enzym ít bị thay đổi qua quá trình cố định. Để bao được enzym trong khuôn gel, tiến hành trùng hợp hóa các gel khi có mặt enzym. Sau khi kết thúc quá trình trùng hợp hóa ta thu được
được giữ chặt ở trong lỗ gel. Có thể nghiền nhỏ gel đã có enzym bằng cách đồng hóa hoặc ép qua rây rồi đem sấy khô ở nhiệt độ thấp.
Phương pháp này khá phổ biến. Enzym thường được nhốt trong gel của polyacrylamide, polyhydroxymethacrylate, polyvinylpirolindon và một số gel khác.
Calcium alginate là một trong những vật liệu thích hợp cho phương pháp nhốt enzym. Hỗn hợp enzym và alginate được nhỏ xuống dung dịch CaCl2 để tạo hạt. Gel alginate có khả năng nhốt một lượng lớn tế bào và enzym. Gel này không bền trong môi trường có phosphat. Bên cạnh đó, colagen là vật liệu protein có thể dùng để nhốt enzym trong gel của nó, nhờ vào khả năng khâu mạch của gel trong dung dịch khâu mạch glutaraldehyde. Khi khâu mạch hạt gel không tan, có tính ổn định cao.
Hiệu quả của việc nhốt và và hoạt độ riêng của enzym cố định phụ thuộc vào thành phần và tính chất của gel. Nhược điểm của phương pháp này là enzym cố định có thể bị giảm hoạt tính do sự phân bố không đều của enzym trong gel. Thực nghiệm cho thấy chỉ những enzym nằm gần bề mặt gel là tiếp xúc được với cơ chất và tham gia xúc tác phản ứng.
Các enzym cố định như trypsin, chymoptrypsin, alcoldehydrogenase, cholinesterase, ribonuclease và một số enzym cố định khác thường được điều chế bằng phương pháp này.
Phương pháp microcapsule (phương pháp tạo vi túi)
Đây là một hướng cố định enzym bằng phương pháp vật lý được sử dụng rộng rãi hiện nay, quá trình tạo vi túi có màng không thẩm thấu đối với enzym và chất có trọng lượng phân tử cao nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm dễ dàng thẩm thấu qua. Phương pháp này cho phép giữ enzym trong dung dịch gần giống với tự nhiên và sử dụng enzym nhiều lần vì có thể tách và thu nó dễ dàng khỏi sản phẩm của quá trình phản ứng bằng cách lọc.
Có 3 phương pháp chủ yếu để nhốt enzym trong màng bán thấm:
- Phương pháp trùng ngưng giữa phase, quá trình tạo màng xảy ra trong quá trình phản ứng hóa học trên bề mặt phân cách phase.
- Phương pháp tạo màng đông giữa phase nhờ sự giảm độ hòa tan ở ranh giới giữa phase.
- Phương pháp nhũ tương hóa kép là một biến dạng của phương pháp tạo màng đông giữa phase. Bản chất của phương pháp này là dung dịch chứa enzym được nhũ tương hóa vào dịch polymer trong dung môi hữu cơ sau đó nhũ tương được huyền phù hóa trong phase nước tạo thành các khối cầu cứng chứa những giọt nước rất nhỏ cùng với enzym.
Ở hai phương pháp đầu cần có sự tham gia của các chất độn trơ ở nồng độ khoảng 10% để duy trì áp suất bên trong capsule, nhằm ổn định enzym và pH của dung dịch bên trong vi túi. Phương pháp thứ ba có ưu điểm là có khả năng lựa chọn các giá trị pH bất kỳ. Thông thường, microcapsule được tạo thành bởi 2 phương pháp trùng ngưng giữa phase hay tạo màng đông giữa phase có kích thước từ vài chục cho đến vài trăm micromet, màng dầy khoảng phần chục, phần trăm micromet. Phương pháp nhũ tương hóa kép cho màng dày hơn.
Phương pháp tạo microcapsule rất tiện lợi để cố định các hệ polyenzym (đa enzym). Bên cạnh việc tạo microcapsule bằng màng bán thấm còn có thể tạo microcapsule bằng màng thể lỏng. Màng thể lỏng là một phase không tan trong nước cấu tạo từ các chất có hoạt tính bề mặt, dung môi hữu cơ và các chất ổn định, phase này chứa các giọt nhũ có kích thước từ vài micro đến vài mm có chứa dung dịch hay dịch huyền phù của enzym. Ưu điểm của phương pháp này là toàn bộ quá trình xảy ra trong một giai đoạn, capsule có tỉ lệ diện tích bề mặt so với thể tích cao, tuy nhiên cũng có thể xảy ra việc thất thoát.
Phương pháp siêu lọc
Ở phương pháp này, enzym được giữ lại trong các màng, các sợi siêu lọc. Những sợi này được chế tạo từ những polymer tự nhiên hoặc tổng hợp. Sự cố định có hiệu quả enzym trong vật liệu xốp có kích thước lỗ ở thành sợi từ 5 – 10 mm có thể thực hiện bằng cách làm đầy thể tích sợi bằng dung dịch enzym và ủ trực tiếp enzym trong đó. Khi hệ trên hoạt động thì cơ chất sẽ đi qua
những lỗ của sợi (phương pháp tái hồi lưu) hoặc dưới áp suất đi qua lỗ vào của lớp vỏ, trong khi lỗ ra đóng (phương pháp rửa ngược).
Phương pháp này đã được sử dụng để cố định các enzym gluco amylase, gluco isomerase, galactosidase.
1.3.5.4. Lựa chọn phương pháp cố định [15]
Xác định phương pháp cố định enzym đóng vai trò quan trọng trong thực hiện thành công việc cố định enzym.Để quá trình cố định có kết quả cần phải để ý đến các yếu tố sau:
- Enzym phải cố định trong những điều kiện diễn ra phản ứng.
- Các chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang chủ yếu chỉ tương tác với các nhóm chức năng nằm ngoài trung tâm hoạt động của enzym.Nếu điều trên không thực hiện được thì chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang phải có kích thước lớn không cho phép nó xâm nhập vào trung tâm hoạt động của enzym.
- Tâm hoạt động phải luôn được bảo vệ, đôi khi có thể che tâm hoạt động bằng cách bổ sung vào hỗn hợp phản ứng cơ chất đã được bão hòa bởi enzym.
- Biện pháp rửa tách enzym không được gắn phải cẩn thận, không gây ảnh hưởng xấu đến enzym đã được gắn.
- Cần tính đến các tính chất cơ học của chất mang. Điều này quan trọng hơn với những chất mang được sử dụng trong những cột lớn.