Nghiệm thức Vaccine sử dụng Đường cấp Số lần lập lại Số gà mỗi nghiệm thức Thời gian tiêm chủng (ngày)
NT1 Không Không 3 15 Không
NT2 Lasota Nhỏ mắt 3 15 7 và 21
Mô tả nghiệm thức: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nghiệm thức (mỗi nghiệm thức là 15 con gà) với 3 lần lập lại. Ở nghiệm thức 1 (NT1) không dùng vaccine, nghiệm thức 2 (NT2) dùng vaccine Lasota (Navetco) để chủng ngừa cho gà. Gà được chủng ngừa 2 lần vào lúc 7 ngày tuổi và 21 ngày tuổi.
Gà thí nghiệm được tiêm phòng đầy đủ các bệnh theo quy trình phòng bệnh chung.
Hình 3.3 Chủng ngừa vaccine cho gà
Phương pháp thu thập mẫu để đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine Lasota.
Để theo dõi sự truyền kháng thể thụ động từ đàn gà giống bố mẹ sang gà con, chúng tôi thực hiện lấy máu trên NT1 (không tiêm vaccine), thời điểm lấy máu lúc 3 ngày, 10 ngày, 17 ngày, 24 ngày và sau đó mỗi tháng lấy máu một lần cho đến khi kết thúc thí nghiệm, lấy 5 mẫu.
Để kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle và để đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine Lasota (Navetco) chúng tôi lấy máu thực hiện phản ứng HA và HI. Lấy máu tĩnh mạch cánh lúc gà 35 ngày tuổi (sau 2 tuần khi tiêm vaccine lần 2), lúc 49 ngày và lúc 75 ngày tuổi, mỗi lần lấy 5 mẫu.
Phương pháp lấy máu để kiểm tra kháng thể trong các lô gà thí nghiệm: mỗi con lấy khoảng (0,5ml-2ml) máu cho vào ống nghiệm vô trùng, để nghiêng 1 gốc 45o và giữ yên khoảng 30 phút cho đến khi ra huyết thanh, tiến hành chiết huyết thanh cho vào ependoff, ghi lại ký hiệu của gà thí nghiệm.
Hình 3.4 Lấy máu tim trên gà con
Bảo quản mẫu: máu sau khi lấy sẽ được trữ ở 4oC trong thùng trữ mẫu rồi chuyển đến phòng thí nghiệm. Mẫu huyết thanh phải được bảo quản trong điều kiện lạnh (từ 2-8 o
C) nếu tiến hành xét nghiệm ngay trong vòng 48-72 giờ. Nếu mẫu chưa được xét nghiệm trong vòng 48-72 giờ thì giữ trong tủ âm (-20 oC) đến khi xét nghiệm.
Thí nghiệm 2: Theo dõi sự tăng trọng của gà Tàu Vàng sau khi tiêm phòng vaccine
Từ các nghiệm thức trên chúng tôi theo dõi sự tăng trọng của gà Tàu Vàng qua các nghiệm thức, gà được chúng tôi theo dõi qua 3 giai đoạn. Trong đó, giai đoạn nuôi úm từ 0-3 tuần tuổi (nuôi trên chuồng lòng) và giai đoạn nuôi tăng trưởng từ 3-6 tuần tuổi và giai đoạn thịt từ 6-12 tuần tuổi (dưới nền).
Các lô gà thí nghiệm được cho ăn cùng một loại thức ăn hỗn hợp Proconco, được chăm sóc và nuôi dưỡng như nhau để khảo sát về sự tăng trọng và hệ số chuyển hóa thức ăn.
Tăng trọng của gà (g/con/ngày) được xác định bằng cách cân khối lượng gà trước khi bố trí thí nghiệm để xác định trọng lượng ban đầu, sau đó cân vào cuối mỗi giai đoạn và lúc kết thúc thí nghiệm. Gà thí nghiệm được cân vào lúc sáng sớm trước khi cho ăn, gà được cân từng con và cân toàn bộ số gà có trong mỗi đơn vị thí nghiệm. Tăng trọng bình quân của gà được tính theo công thức sau:
Trọng lượng gà mỗi giai đoạn – trọng lượng gà ban đầu Tăng trọng (g/con) =
Số ngày thí nghiệm
Hệ số chuyển hóa thức ăn được xác định dựa vào lượng thức ăn tiêu thụ và tăng trọng của gà và được thể hiện qua công thức dưới đây:
Tiêu tốn thức ăn trong giai đoạn thí nghiệm (g/con) Hệ số chuyển hóa thức ăn =
Tăng trọng trong giai đoạn thí nghiệm (g/con)
Hình 3.5 Cân gà khi kết thúc thí nghiệm
Thí nghiệm 3: Theo dõi sự thay đổi hàm lượng bạch cầu sau khi tiêm phòng vaccine.
Từ hai nghiệm thức trên chúng tôi theo dõi sự thay đổi hàm lượng bạch cầu trước và sau khi tiêm vaccine của gà Tàu Vàng máu được lấy sáng sớm trước khi cho gà ăn và vận động trên lô không tiêm vaccine (NT1) để kiểm tra hàm lượng bạch cầu trước khi tiêm vaccine. Tương tự lô tiêm vaccine (NT2) gà được lấy máu hai lần sau khi tiêm vaccine lần 1 và lần 2 (thời điểm lấy 10
ngày và 24 ngày). Các mẩu máu cho vào ống nghiệm chứa chất chống đông (heperin), ghi ký hiệu và đưa đến phòng thí nghiệm bệnh viện 121 CHC-QK9.
3.3.3 Qui trình thực hiện phản ứng HA
Nguyên lý: virus Newcastle có khả năng ngưng kết hồng cầu. Khi hồng cầu được rửa sạch bằng nước sinh lý 0,85% sẽ bộc lộ ra những thụ thể bề mặt và virus Newcastle sẽ kết hợp với hồng cầu qua thụ thể này. Kết quả là hồng cầu sẽ dàn đều trong giếng của đĩa nhựa microplate chữ U khi thực hiện phản ứng. Đây là đặc điểm quan trọng để xác định một cách gián tiếp sự hiện diện của virus, và chuẩn độ kháng nguyên virus Newcastle dùng cho phản ứng HI. Thành phần phản ứng: kháng nguyên là vaccine chủng Lasota, nước sinh lý 0,85%, hồng cầu gà pha loãng 1% trong nước sinh lý.
Tiến hành phản ứng HA: dùng micropipet nhỏ 25µl nước sinh lý vào 12 giếng của đĩa nhựa microplate. Cho vào giếng thứ nhất 25µl kháng nguyên, như vậy kháng nguyên được pha loãng 1/2 trong nước sinh lý, trộn đều rùi hút 25µl của giếng thứ nhất chuyển sang giếng thứ 2 và làm tiếp tục cho đến giếng thứ 11 rút bỏ 25µl. Giếng thứ 12 làm đối chứng hồng cầu, chỉ có 25µl nước sinh lý và 25µl huyễn dịch hồng cầu gà 1%. Thêm vào mỗi giếng 25µl hồng cầu 1%, lắc nhẹ đĩa nhựa để trộn đều kháng nguyên và hồng cầu, để ở nhiệt độ 4oC, đọc kết quả sau 30 phút.
Đọc kết quả phản ứng HA: dương tính xảy ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu. Âm tính hồng cầu tụ lại thành một cụm tròn ở đáy giếng.
Hiệu giá ngưng kết của kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của kháng nguyên còn khả năng ngưng kết và được gọi là một đơn vị ngưng kết hay một đơn vị HA. Bảng 3.3 Trình tự tiến hành phản ứng HA Số giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Nước sinh lý 0,85% 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Kháng nguyên (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 Hồng cầu (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Để ở nhiệt độ 4o C trong 30 phút
3.3.4 Qui trình thực hiện phản ứng HI
Nguyên lý: khi cho huyết thanh có kháng thể kháng virus có khả năng ngưng kết hồng cầu tương ứng thì sau một thời gian virus sẽ bị trung hòa và mất khả năng ngưng kết hồng cầu.
Trong phản ứng này người ta sử dụng lượng kháng nguyên nhất định, còn huyết thanh được pha loãng cho đến khi lượng kháng thể có trong huyết thanh không còn đủ khả năng ngăn trở hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
Thành phần phản ứng: nước sinh lý 0,85%, kháng nguyên có 4 đơn vị ngưng kết pha loãng trong dung dịch sinh lý 0,85%, hồng cầu gà 1% pha trong nước sinh lý 0,85%
Tiến hành phản ứng HI: dùng micropipet hút 25µl nước sinh lý cho vào mỗi giếng của đĩa micropiplate từ giếng 1 đến giếng thứ 12. Dùng micropipet hút 25µl huyết thanh gà cần xét nghiệm cho vào giếng thứ nhất trộn đều. Như vậy huyết thanh được pha loãng 1/2. Hút 25µl chuyển sang giếng thứ hai, trộn đều, hút 25µl chuyển sang giếng thứ ba tiếp tục như vậy cho đến giếng thứ 9 rút bỏ 25µl. Cho vào mỗi giếng 25µl kháng nguyên (ở 4 đơn vị HA pha loãng trong nước sinh lý 0,85%). Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng thể hiện diện trong huyết thanh liên kết với kháng nguyên. Thêm vào mỗi giếng 25µl huyễn dịch hồng cầu gà 1% lắc đều. Sau đó để ở nhiệt độ 4oC cho đến khi các tế bào hồng cầu trong giếng đối chứng đóng thành nút rõ ràng dưới đáy giếng. Đọc kết quả sau 30 phút. Bảng 3.4. Trình tự tiến hánh phản ứng HI Số giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (ĐCA) 11 (ĐCD) 12 (ĐCHC) Nước sinh lý 0,85% 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Huyết thanh (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Kháng nguyên (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Để ở nhiệt độ 4o C trong 30 phút Hồng cầu (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Để ở nhiệt độ 4o C trong 30 phút
Thực hiện phản ứng đối chứng: giếng thứ 10, thứ 11 làm đối chứng âm với đối chứng dương, thực hiện tương tự như các mẫu huyết thanh kiểm tra nhưng thay đổi huyết thanh cần kiểm tra bằng mẫu huyết thanh âm tính và dương tính chuẩn. Giếng thứ 12 để làm đối chứng hồng cầu: 25µl nước sinh lý và 25µl huyễn dịch hồng cầu gà 1%.
Đọc phản ứng HI: giếng nào không xảy ra ngưng kết hồng cầu là dương tính,giếng nào có ngưng kết hồng cầu là âm tính. Hiệu giá ngăn trở ngưng kết hồng cầu của huyết thanh là độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh còn có khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu có thể đọc được. Dương tính ở giếng thứ 1 đến giếng thứ 9 tương ứng với hiệu giá1/2 đến 1/521. Phản ứng âm tínhhồng cầu xuất hiện từng cụm ngưng kết ở đáy giếng.
Hình 3.6 Kết quả phản ứng HI
Tiêu chí đánh giá: Hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2) được coi là hiệu giá bảo hộ của cá thể gia cầm, đàn gia cầm được bảo hộ là đàn có ≥ 70% số cá thể có hiệu giá HI ≥ 1/16 4log2 (Cục thú y, 2005).
3.4 Phương pháp phân tích số liệu
So sánh tỷ lệ bảo hộ của gà Tàu Vàng giữa các ngày bằng phương pháp Fisher_Exactly_test1.
So sánh trọng lượng và hàm lượng bạch cầu của gà giữa các nghiệm bằng phân tích phương sai so sánh các trị số trung bình bằng ANOVA, sử dụng mềm Minitab 13.
CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả kháng thể thụ động của gà Tàu Vàng
Kết quả kháng thể thụ động của gà Tàu Vàng được trình bày qua bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả kháng thể thụ động của gà Tàu Vàng (n=5) Ngày tuổi
Hiệu giá kháng thể (x log2) <4 4 5 6 7 8 9 Số mẫu ≥ 4log2 Tỷ lệ bảo hộ (%) GMT 3 ngày tuổi 1 2 2 0 0 0 0 4 80 13,92 10 ngày tuổi 2 2 1 0 0 0 0 3 60 10,55 17 ngày tuổi 3 2 0 0 0 0 0 2 40 6,90 24 ngày tuổi 5 0 0 0 0 0 0 0 0,00 3,48 1 tháng 5 0 0 0 0 0 0 0 0,00 1,14
n: số mẫu kiểm tra
GMT: hiệu giá kháng thể trung bình học
Qua kết quả bảng 4.1 cho thấy kháng thể thụ động trên gà Tàu Vàng cao nhất lúc gà 3 ngày tuổi (80%) sau đó giảm dần đến 10 ngày tuổi (60%) và 17 ngày tuổi (40%) khi gà được 24 ngày tuổi hết bảo hộ. Qua phân tích thống kê không có sự khác biệt về tỷ lệ bảo hộ lúc gà 3 ngày tuổi, 10 ngày tuổi và 17 ngày tuổi (P>0,05). Hiệu giá kháng thể thụ động trung bình cũng dao động và giảm dần từ 3 ngày tuổi (13,92) đến 1 tháng (1,14).
Theo Lâm Minh Thuận (2004) hàm lượng kháng thể thụ động ở gà con phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể mẹ truyền. Nếu hàm lượng kháng thể ở gà mẹ cao thì lượng kháng thể mẹ truyền đủ bảo hộ gà con trong giai đoạn đầu. Kháng thể tồn tại ở gà con từ 20-30 ngày. Thông thường lượng kháng thể mẹ truyền hết hẳn vào ngày thứ 28.
Hàm lượng kháng thể thụ động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả đáp ứng miễn dịch trong phòng bệnh Newcastle, nếu hàm lượng kháng thể thụ động cao mà đưa vaccine vào, kháng thể thụ động sẽ trung hòa với kháng nguyên có trong vaccine làm giảm lượng kháng thể tạo ra, nên khả năng miễn dịch của đàn gà sẽ giảm (trích dẫn Vũ Thị Thanh Ngân, 2010).
Việc xác định hiệu giá kháng thể thụ động để đặt chương trình chủng có một ý nghĩa quan trọng. Nếu ta biết được hiệu giá kháng thể thụ động ở gà con thì ta dễ dàng xác định được thời điểm chủng ngừa thích hợp.
4.2 Đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine Lasota phòng bệnh Newcastle
Kết quả kháng thể của gà Tàu Vàng lúc 35 ngày tuổi sau khi tiêm vaccine lần hai được trình bày qua bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả kháng thể ở gà 35 ngày tuổi (n=5) Hiệu giá kháng thể (x log2)
<4 4 5 6 7 8 9 Số mẫu ≥ 4log2 Tỷ lệ bảo hộ (%) GMT 1 2 1 1 0 0 0 4 80 21.11
n: số mẫu kiểm tra NT2: vaccine Lasota
GMT: hiệu giá kháng thể trung bình
Qua kết quả bảng 4.2 cho thấy khả năng đáp ứng miễn dịch của giống gà Tàu Vàng lúc gà 35 ngày tuổi đạt tỷ lệ bảo hộ cao là 80%. Ngoài ra hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) cũng rất cao (21.11) với mức hiệu giá này đã tạo miễn dịch chắc chắn cho đàn gà chống lại bệnh Newcastle. Theo Allan và Gough (1974), đàn gà có hiệu giá kháng thể trung bình ≥ 8 (3log2) thì có khả năng miễn dịch với bệnh Newcastle. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Trường Giỏi (1999) sau khi tiêm vaccine lần hai (gà được 35 ngày tuổi) tỷ lệ đáp ứng miễn dịch của gà trên 70% đạt tỷ lệ bảo hộ.
Theo Nguyễn Bá Hiên (2007), khi tiêm vaccine lần một và lần hai cách nhau 3 đến 4 tuần, sử dụng tiếp lần thứ hai thì đáp ứng miễn dịch sẽ nhanh hơn, mạnh hơn, có thể gấp hàng trăm lần và thời gian miễn dịch dài hơn.
Đồng thời giống gà này đã được nuôi ở Việt Nam rất lâu đời nên thích nghi với điều kiện thời tiết, khí hậu ở nước ta. Sau khi tiêm phòng bệnh bằng vaccine Newcastle, gà cho đáp ứng miễn dịch trên 80% sẽ giúp cho đàn gà chống lại được với virus Newcastle.
Kết quả kháng thể của gà Tàu Vàng lúc 49 ngày tuổi sau khi tiêm vaccine lần hai được trình bày qua bảng 4.3.
Bảng 4.3 Kết quả kháng thể ở gà 49 ngày tuổi (n=5) Hiệu giá kháng thể (x log2)
<4 4 5 6 7 8 9 Số mẫu ≥ 4log2 Tỷ lệ bảo hộ (%) GMT 1 3 1 0 0 0 0 4 80 10,58
n: số mẫu kiểm tra NT2: vaccine Lasota
GMT: hiệu giá kháng thể trung bình
Kết quả bảng 4.3 cho thấy tỷ lệ bảo hộ lúc gà 49 ngày tuổi vẫn là 80%. Hiệu giá kháng thể trung bình là 10.55 giảm nhưng vẫn còn ở mức cao vẫn còn tạo
miễn dịch chắc chắn cho đàn gà. Hiệu giá kháng thể ở thời điểm này giảm so với thời điểm 35 ngày tuổi, điều này cũng phù hợp với cơ chế tồn tại tự nhiên của kháng thể. Kết quả này cũng phù hợp với Dương Nghĩa Quốc (1997) đáp ứng miễn dịch hình thành sớm và tăng cao trong hai tuần đầu sau khi tiêm vaccine lần hai, rồi sau đó giảm dần.
Kết quả kháng thể của gà Tàu Vàng lúc 75 ngày tuổi sau khi tiêm vaccine lần hai được trình bày qua bảng 4.4.
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra kháng thể xuất hiện lúc 75 ngày tuổi (n=5) Hiệu giá kháng thể (x log2)
<4 4 5 6 7 8 9 Số mẫu ≥ 4log2 Tỷ lệ bảo hộ (%) GMT 2 2 1 0 0 0 0 3 60 6,10
n: số mẫu kiểm tra NT2: vaccine Lasota
GMT: hiệu giá kháng thể trung bình học
Bảng 4.4 cho thấy đến giai đoạn gà Tàu Vàng 75 ngày tuổi thì kết quả hàm lượng kháng thể đã giảm xuống rõ rệt. Tỷ lệ bảo hộ giảm còn 60%. Hiệu giá kháng thể trung bình nhỏ hơn 8 (3log2) không còn đủ khả năng miễn dịch với bệnh Newcastle. Vì vậy, đối với các đàn gà giống và đàn gà chuyên trứng do có thời gian nuôi dưỡng kéo dài, cần chú ý tiêm phòng nhắc lại để giúp đàn gà có đáp ứng miễn dịch cao hơn. Kết quả này cũng phù hợp với nhiều qui trình phòng bệnh Newcastle hiện nay được khuyến cáo là sau khi chủng ngừa vaccine Lasota ở 21 ngày tuổi, gà cần chủng ngừa lại lúc 60 ngày tuổi bằng vaccine chủng M (Hồ Thị Việt Thu, 2012).
4.3 Trọng lượng và tăng trọng của gà Tàu Vàng
Trọng lượng của gà Tàu Vàng của hai nghiệm thức qua các tuần tuổi được trình bày qua bảng 4.5.
Bảng 4.5 Trọng lượng của gà Tàu Vàng
Tuần tuổi Trọng lượng (g/con)
NT I ±SE NT II ±SE P
0 tuần 31a 1.16 32a 1.16 0,545
3 tuần 116a 4.4 136b 4.4 0,003