2. Thiết bị và dụng cụ
2.4.2.Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH, nguồn nitơ, nguồn cacbon, đến sinh
sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (môi Czapek-Dox Broth) Cao nấm men 3 g Glucose 20 g K2HPO4 0.5 g KH2PO4 0.05 g MgSO4.7H20 0.5 g NaCl vài mg Nước cất 1000ml
2.4.3. Môi trường quan sát vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường YEA)
Glucose 20g
Cao nấm men 4g
Agar 20g
Nước cất 1000ml
2. 5. Các phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Phương pháp phân lập
a. Phương pháp thu mẫu
Thu thập những xác côn trùng vào buổi sáng. Nếu cơ thể chúng mềm và bẩn, chúng có thể bị nhiễm vi khuẩn hoặc virus. Nếu cơ thể chúng cứng, điều đó chứng tỏ sự nhiễm nấm.
tôi tiến hành phối trộn chung hết tất cảc các mẫu thu được. Sau đó tiến hành các phương pháp phân lập [6].
b. Phương pháp phân lập
Tiến hành khử trùng mẫu xác côn trùng bằng HgCl2 0.1%. Sau đó rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng nhiều lần.
Dùng đũa thuỷ tinh vô trùng nghiền mẫu với 10ml nước cất vô trùng. Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1
, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.
Dùng pipet vô trùng hút 0.1 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-6 và tiến hành trãi đĩa trên môi trường PGA [6].
c. Phương pháp làm thuần (Phương pháp cấy đỉnh sinh trưởng nấm)
Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm là quá trình cấy truyền đỉnh sinh trưởng của một sợi nấm để tạo một mẫu nấm thuần
- Đổ môi trường PGA vào đĩa Petri để nghiêng sao cho phần thạch ở một phía của đĩa nông.
- Cấy truyền một miếng nhỏ nấm từ đĩa phân lập vào một bên đĩa nơi thạch sâu hơn.
- Đặt đĩa dưới kính lúp soi nổi và điều chỉnh tiêu điểm sợi nấm ở rìa tản nấm (Các sợi nấm sẽ mọc rất thưa ở phần nông của thạch)
- Điều chỉnh nguồn sáng (gương) nhằm đạt độ tương phản tốt giữa môi trường và sợi nấm.
- Dùng que cấy dẹp đã khử trùng cấy một miếng thạch nhỏ chứa đỉnh sinh trưởng của một sợi nấm sang một đĩa môi trường thích hợp.
2.5.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng
− Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường PGA tiến hành hấp khử trùng. Sau khi hấp xong để nghiêng một góc 45 ° C các ống thạch này trên giá gỗ.
− Tiến hành cấy truyền giữ giống nấm trên bề mặt thạch nghiêng. Sau đó bảo quản các ống giống này trong điều kiện lạnh (3-5 ° C)
2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi a. Quan sát đại thể a. Quan sát đại thể
Cấy nấm sợi vào ống thạch nghiêng, sau 3 ngày cho 5ml nước cất vô trùng vào ống. Dùng que cấy vô trùng gạt đều bào tử nấm sợi trong ống giống, sau đó lăn nhẹ ngón tay để tạo thành dịch huyền phù. Dùng que cấy vô trùng nhúng nhẹ vào dịch huyền phù rồi cấy nhẹ 1 điểm vào đĩa Petri có chứa môi trường PGA. Quan sát từng ngày khuẩn lạc về các đặc điểm sau:
- Tốc độ phát triển của khuẩn lạc.
- Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc.
- Hình dạng khuẩn lạc, mép khuẩn lạc và sợi nấm.
- Giọt tiết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Sắc tố tiết vào môi trường.
b. Quan sát vi thể (tiêu bản phòng ẩm)
− Chuẩn bị các đĩa Petri vô trùng chứa lam, lamen và một miếng giấy lọc.
− Chuẩn bị một đĩa Petri môi trường PGA với độ dày môi trường thật mỏng.
− Dùng kim mũi mác vô trùng cắt lấy một miếng thạch từ đĩa Petri môi trường PGA (kích thước miếng thạch 1x1cm) dặt lên lam chứa trong đĩa Petri vô trùng được chuẩn bị ở trên.
− Dùng que cấy đầu vuông lấy một ít bào tử nấm Purpureocillium lilacinum từ các ống giống chấm vào 2 điểm đối diện của miếng thạch PGA trên lam. Sau đó đậy lamen lên và dùng nước cất vô trùng làm ướt miếng giấy lọc trong đĩa Petri.
− Sau 3 ngày nuôi cấy lấy tiêu bản phòng ẩm ra và nhuộm bằng xanh metylen loffer. Quan sát tiêu bản phòng ẩm dưới kính hiển vi về các đặc điểm: cấu trúc hệ sợi nấm (có hay không có vách ngăn), cấu trúc cuống sinh bào tử, thể bình, hình dạng và cách sắp xếp bào tử [3].
2.5.4. Phương pháp định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử
− Thu nhận DNA
• Phá màng tế bào và màng nhân bằng proteinase đặc hiệu để giải phóng DNA, đồng thời phân huỷ các protein liên kết với DNA.
• Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA.
• Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu các acid nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản.
− Chạy PCR
• Biến tính: trong một hỗn hợp đầy đủ các thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử (khoảng 94°-95° C), trong 30 giây-1 phút.
• Lai: nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động khoảng từ 40°-70° C và kéo dài trong vòng 30 giây- 1 phút.
• Tổng hợp: nhiệt độ tăng lên đến 72° C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây- vài phút.
− Giải trình tự DNA [3].
2.5.5. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng
Rây lọc được xếp một lớp giấy lên trên và đặt vào đĩa Petri, sau đó lấy rễ cho vào rây lọc, điều chỉnh lượng nước vừa ngập rễ trên rây, đậy nắp và đặt yên tĩnh trong 48h ở nhiệt độ phòng. Tuyến trùng sống chui qua rây lọc, lắng đọng xuống đáy đĩa Petri.
Nhấc rây ra khỏi đĩa Petri thu lại dịch nước chứa tuyến trùng trong đĩa Petri [2].
2.5.6. Phương pháp đếm tuyến trùng
Tuyến trùng được đếm bằng đĩa đếm tuyến trùng dưới kính hiển vi soi nổi. Nếu mẫu có ít tuyến trùng:
• Đổ dung dịch tuyến trùng vào đĩa đếm. sau đó lắc nhẹ cho dung dịch tuyến trùng dàn đều.
• Đếm toàn bộ tuyến trùng theo các dãy ô cho toàn bộ đĩa hay đếm đại diện một số ô hoặc dãy, sau đó tính trung bình một ô và nhân với tổng số ô trong đĩa. Nếu mẫu quá nhiều tuyến trùng có thể pha loãng dung dịch tuyến trùng thành 30ml, sau đó lấy 1ml để đếm, lặp lại 5 lần như vây, tính trung bình số lượng tuyến trùng trên 1ml rồi nhân với 30 [2].
2.5.7. Phương pháp định danh tuyến trùng bằng hình thái
a. Phương pháp xử lý, làm tiêu bản tuyến trùng theo De Grisse (1969)
− Ngày thứ nhất: nhặt tuyến trùng chuyển vào giếng có chứa 0.5ml dung dịch I (99ml Formalin 40% + 1 ml glycerine). Với mỗi mẫu nhặt khoảng 200 con để định loại, với mẫu có ít tiến hành định loại toàn bộ mẫu. Đặt giếng có tuyến trùng (có đậy lam kính) vào bình hút ẩm chứa 1/10 thể tích ethanol 96 %. Để bình hút ẩm trong tủ ấm ở nhiệt độ 40 °C ít nhất 12 giờ.
− Ngày thứ 2: lấy giếng ra khỏi bình hút ẩm, nhỏ vài giọt dung dịch II ( 95ml ethanol 96% + 5 ml glycerine) vào giếng, đậy lam kính lên giếng để ethanol bay hơi chậm và đặt trong tủ ấm. Cứ sau 2 giờ thì nhỏ 2 giọt dung dịch II, thực hiện 4 lần. Quá trình này nhằm làm mất nước tuyến trùng. Để giếng trongâm1 qua đêm, bổ sung vài giọt dung dịch III (50ml ethanol 96%+ 50ml glycerine) giúp làm mất nước và làm trong tuyến trùng.
− Ngày thứ 3: tuyến trùng đã được sử lý làm mất nước, làm trong nằm trong dung dịch glycerine tinh khiết được sử dụng để lên tiêu bản định loại [1].
b. Phương pháp lên tiêu bản tuyến trùng theo Maeseneer (1963) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
− Hơ nóng ống đồng và cắm vào đĩa paraffin. Sau đó chấm ống đồng lên lam để tạo thành vòng paraffin .
− Nhỏ một giọt glycerine thuần khiết vào giữa vòng paraffin. Dùng que gắp tuyến trùng đã được xử lý trong các giếng vào giọt glycerine (khỏang 5-10 tuyến trùng, chú ý các con tuyến trùng phải xếp cùng chiều và không chồng lên nhau).
− Đặt khoảng 3 viên paraffin xung quanh vòng paraffin sau đó đậy lamen lên. Đặt lam và lamen có tuyến trùng lên thanh sắt nóng cho paraffin chảy ra [1].
c. Phương pháp định danh tuyến trùng
− Quan sát dưới kính hiển vi quan học lần lượt ở các vật kính 10X, 20X, 40X, 100X. Phác hoạ sơ bộ hình thái tuyến trùng như: kích thước, có kim hút hay không có kim hút, hình dạng vùng môi, cơ quan sinh dục…
− Dựa vào đặc điểm hình thái đặc trưng cho từng nhóm tuyến trùng như: lớp cutin, amphid, vùng môi, buồng trứng, kim hút để định loại. sử dụng khoá phân loại theo tài liệu của Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh (2000) [1].
2.5.8. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điêù kiện in vitro Purpureocillium lilacinum trong điêù kiện in vitro
a. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát sự nở của trứng tuyến trùng
Meloidogyne sp. bởi nấm Purpureocillium lilacinum
Cách tiến hành:
− Chuẩn bị huyền phù trứng tuyến trùng:
• Dùng kim mũi mác tách lấy khối trứng tuyến trùng cho vào ống nghiệm chứa nước cất. Cho thêm 4-5 ml NaClO 1,05% vào lắc trong vòng 5 phút. Sau đó để yên cho các mãnh vở lắng xuống trong 30 giây.
• Dùng pipet hút phần trong ở phía trên của ống nghiệm chuyển lên ray lọc kích thước 15 μm. Sau đó dùng nước cất vô trùng rửa sạch NaClO.
• Chuyển ray lọc chứa trứng tuyến trùng vào đĩa Petri chứa dung dịch ampicilline 0.1% để khử trùng trong 10 phút. Sau đó dùng nước cất vô trùng rửa lại [14]. Bố trí thí nghiệm: lô thí nghiệm: 1ml huyền phù bào tử nấm Purpureocillium lilacinum
(105 bào tử/ml) + 0.5ml huyền phù trứng tuyến trùng (khoảng 100 trứng/ 0.5ml) cho vào ống nghiệm.
− Lô đối chứng: 1ml nước cất vô trùng + 0.5ml huyền phù trứng tuyến trùng (khoảng 100 trứng/ 0.5ml). Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 1 tuần.
− Thu kết quả: quan sát và đếm số lượng trứng không nở, IJ2 chết, IJ2 sống trong các đĩa đếm tuyến trùng dưới kính lúp sôi nổi. Đối với trứng tuyến trùng bị ký sinh bởi nấm Purpureocillium lilacinum dùng kim tiêm 500cc thu ngẫu nhiên 100 trứng tuyến trùng chuyển lên lam nhuộm bằng xanhmethylen loffer và quan sát bằng kính hiển vi
[10], [14].
− Cách đánh giá kết quả:
Tỉ lệ trứng không nở= số trứng không nở/ (trứng + IJ2)X 100 Tỉ lệ IJ2 chết= IJ2 chết/ tổng IJ2x100
b. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp.
bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điều kiện in vitro
− Tiến hành nuôi cấy huyền phù bào tử nấm Purpureocillium lilacinum (105 bào tử/ml) trên các đĩa Petri môi trường PGA.
− Sau 5 ngày nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum trên môi trường PGA tiến hành cấy tuyến trùng cái Meloidogyne sp. (5 tuyến trùng cái/ 1 đĩa PGA) vào mép khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum. Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 4 ngày.
− Sau mỗi ngày thu kết quả thí nghiệm bằng cách dùng nước cất vô trùng cho vào các đĩa Petri rồi dùng kim mũi mác thu tuyến trùng cái. Quan sát sự lây nhiễm nấm
Purpureocillium lilacinum trên tuyến trùng cái bằng cách làm tiêu bản nhuộm với xanh metylen loffer và soi dưới kính hiển vi [10].
2.5.9. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum
a. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh khối và số lượng bào tử
Tiến hành nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum trong các bình tam giác 250ml chứa môi trường Czapek-Dox Broth (100 ml/ bình) với các giá trị pH khác nhau: 6, 6.5, 7, 7.5. Đặt các bình này trong tối, nhiệt độ phòng và tiến hành nuôi cấy tĩnh.
Sau 14 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử bằng cách cho dịch nuôi cấy lọc qua giấy lọc kích thước 15-20 μm thu lấy sinh khối trên giấy lọc và dịch lọc chứa bào tử. Việc thu sinh khối và dịch bào tử được tiến hành trong tủ cấy vô trùng [17]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ và Cacbon đến sinh khối và số lượng bào tử
Tiến hành nuôi cấy nấm trong môi trường Czapek-Dox Broth nhưng thay thế nguồn nitơ cao nấm men bằng nguồn nitơ khác nhau như: (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3. Đặt các bình này trong tối, nhiệt độ phòng và tiến hành nuôi cấy tĩnh.
- Sau 14 ngày nuôi cấy trong các bình tam giác tiến hành thu sinh khối và bào tử. Cách thu sinh khối và bào tử tiến hành tương tự như ở mục 2.5.9.1
- Tương tự ảnh hưởng của nguồn cacbon cũng tiến hành nuôi cấy trong môi trường Czapek- Dox Broth nhưng thay thế glucose bằng các nguồn cacbon khác nhau như: huyền phù tinh bột, saccharose. Sau 14 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử.
2.5.10. Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov
- Sinh khối nấm sợi được xác định dựa vào trọng lượng khô tuyệt đối.
- Lọc dịch lên men qua giấy lọc, rửa sạch sinh khối nấm sợi bằng HCl 1N và nước cất. Sấy khô tờ giấy lọc có sinh khối nấm sợi ở 80- 105 °C đến trọng lượng không đổi. Sinh khối đựơc tính theo sự chênh lệch trọng lượng tờ giấy lọc có sinh khối và tờ giấy lọc khô đã cân trước đó [3].
2.5.11. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật
Nguyên tắc:
- Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa Petri.
- Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển của một tế bào.
Cách lấy mẫu
- Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10-3
, 10-4, 10-5để cấy mẫu.
- Ghi vào nắp hộp Petri có mội trường thạch các thông tin:
- Nồng độ pha loãng.
- Ngày cấy.
- Dùng pipet đã vô trùng lấy 0.1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch.
- Dùng que gạt dàn thật đều trên khắp mặt thạch để tách riêng rẽ từng tế bào.
- Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa Petri và lấy kết quả trung bình.
- Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp [8].
- Cách đếm
Số tế bào/g mẫu = M.a.10 n .N
M: số khuẩn lạc trung bình trong một đĩa. A: số giọt trong 1ml dịch mãu.
n: hệ số pha loãng.
2.5.11. Các phương pháp khác
Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Stargraphic plus 5 [5]. Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Excel [4].
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Phân lập và định danh chủng nấm có khả năng diệt tuyến trùng 3.1.1. Phân lập 3.1.1. Phân lập
Chúng tôi tiến hành phân lập chủng nấm từ các mẫu xác côn trùng bị nhiễm nấm theo mục 2.5.1. Tiến hành định danh sơ bộ bằng các phương pháp ở mục 2.5.3 và căn cứ vào đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc chúng tôi phân lập được 1 chủng nấm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.1: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum
3.1.2. Định danh
Sau khi phân lập và làm thuần, tiến hành định danh sơ bộ nấm bằng cách nuôi chủng nấm này trên môi trường PGA ở nhiệt độ phòng trong vòng 7 ngày. Tiến hành quan sát hình dạng, màu sắc của khuẩn lạc. Làm tiêu bản phòng ẩm quan sát cấu trúc hệ sợi (sự phân nhánh, vách ngăn của sợi nấm), màu sắc sợi nấm, hình dạng và cấu trúc cơ quan sinh sản (cuống sinh bào tử, thể bình, bào tử).
Kết quả định danh sơ bộ
Hình 3.2: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum ( PGA, 7 ngày, 28 °C) Quan sát vi thể
Hình 3. 3: Cấu trúc hệ sợi nấm Purpureocillium lilacinum (1000) (BÊN TRÁI) và cơ
quan sinh sản của nấm Purpureocillium lilacinum (1000) (BÊN PHẢI)
Hình 3.4: Cấu trúc thể bình và cách sắp xếp bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (
400)
So sánh giữa kết quả quan sát được với khoá phân loại của R.A. Samson (1974) Đặc điểm phân loại chủng nấm
Đặc điểm chủng nấm A Đặc điểm phân loại chi Paecilomyces
− Bề mặt khuẩn lạc nhẵn, mịn như nhung. Khuẩn lạc ban đầu có màu trắng sau chuyển thành màu tím.
− Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh và trong suốt không màu.
− Cuống sinh bào tử phân nhánh thẳng đứng.
− Khuẩn lạc của Paecilomyces mọc nhanh và trưởng thành trong vòng 3