4. Ý nghĩa của đề tài
2.2.4.Phương pháp bảo quản màngBC từ A.xylinum
Màng BC sau khi được tạo thành hàng loạt cần được bảo quản để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo và sử dụng để thử nghiệm điều trị bỏng trong thời gian dài mà không mất đi các đặc tính sinh học của màng.
2.2.4.1. Phương pháp sấy khô
Màng sau khi được tẩy rửa và khử khuẩn sẽ được sấy khô ở nhiệt độ 40oC trong 12 giờ. Lúc này, màng BC mỏng và rất dai. Tiếp đó, tiến hành đóng gói bằng máy ép chân không trong các túi nilon ở điều kiện vô trùng.
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 19
Lưu ý: khi đem ra sử dụng màng BC cần được ngâm trở lại với nước cất vô trùng để màng BC hút nước và trở lại hình dạng ban đầu. Sau đó, màng BC sẽ được tẩm thuốc đặc trị bỏng để điều trị vết thương.
2.2.4.2. Bảo quản với chất phụ gia
Khi sấy xong, màng BC sẽ được ngâm tẩm với các chất phụ gia khác nhau trong 12 giờ, sau đó mới được đóng gói bằng máy hút chân không.
Dụng cụ ngâm tẩm màng BC là hộp lồng nhựa, kích thước 10 x 15 cm2, ngâm 1 màng/100ml dung dịch chất phụ gia.
Các chất phụ gia ngâm màng: nước muối sinh lý NaCl 0,9%, Becberin clorid 0,1%, thuốc trị bỏng B76, mật ong, dầu mù u…
Hình 2.8. Màng sau sấy
Hình 2.9. Màng BC ngâm tẩm phụ gia
Hình 2.10. Màng BC tẩm phụ gia đã đóng gói
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 20
Ở phương pháp này, các chất phụ gia sẽ ức chế sự xâm nhiễm của các vi sinh vật và làm tăng khả năng trị bỏng của màng BC.
2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trong cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” [12], và “Thống kê và ứng dụng” [17]như:
* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm. 1 1 n i i X X n
* Trung bình bình phương các sai lệch
1 ) ( 1 2 n X X n i i
* Sai số đại diện của trung bình cộng
m
n
* Hệ số biến thiên trung bình cộng:
X x Cv 100
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nghiên cứu thu nhận màng BC từ chủng A.xylinum BHN2
3.1.1. Lên men tạo màng
Chúng tôi tiến hành lên men tạo màng BC theo 4 bước cơ bản:
Bước 1: chuẩn bị giống (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nhận giống A.xylinum BHN2 thuần từ phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP Hà Nội 2.
- Tiến hành nhân giống bằng phương pháp cấy truyền.
Bước 2: nhân giống cấp 1
- Giống thuần cấy vào môi trường nhân giống cấp 1(1 ống giống /200 ml môi trường nhân giống), nuôi cấy trên máy lắc ổn nhiệt ( 35oC, lắc 130 vòng /phút trong 24 giờ).
Hình 3.12. Giống A.xylinum BHN2 cấp 1 Hình 3.11. A.xylinum BHN2 trên môi trường thạch nghiêng
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 22
Bước 3: nhân giống cấp 2
- Dùng pipet man cấy dịch cấp 1 vào môi trường lên men nhân giống cấp 2 (20 ml dịch cấp 1/200ml môi trường).
- Tiến hành lên men tĩnh trong 4 ngày để tạo màng.
Bước 4: thu màng BC
- Sau 4 ngày, màng đã đảm bảo độ dày. Tiến hành thu và xử màng BC.
Màng BC chưa qua xử lý có diện tích 10x15 cm, dày khoảng 0,5 - 0,7 cm, màu trắng đục và có mùi chua gắt của acid acetic.
3.1.2. Xử lý màng sau lên men
Màng BC sau khi vớt ra khỏi môi trường lên men được xử lý theo phương pháp 2.2.3, kết quả thu được màng BC như hình 3.15:
Hình 3.13. Màng BC chưa xử lý
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 23
Qua nghiên cứu, màng BC sau khi được xử lý bước đầu đã đáp ứng được đủ các chỉ tiêu của vật liệu sử dụng trong điều trị bỏng.
Như vậy, thu nhận màng BC từ chủng A.xylinum BHN2 đáp ứng được các yêu cầu của vật liệu ứng dụng trong điều trị bỏng cần trải qua 2 quá trình là lên men tạo màng và xử lý màng sau lên men.
3.2. Nghiên cứu phương thức đóng gói màng BC
3.2.1. Đóng gói bằng phương pháp thủ công
- Vật liệu đóng gói: là túi nilon thông dụng đã được hấp vô trùng.
- Phương pháp đóng gói: làm kín miệng túi bằng nhiệt hơ trên ngọn lửa đèn cồn.
Hình 3.16. Túi nilon thông thường Hình 3.17. Đóng gói thủ công
Màng BC sau khi được đóng gói bằng phương pháp này được chiếu xạ UV trong 30 phút, rồi được bảo quản và theo dõi ở điều kiện môi trường bình thường. Kết quả sau 7 ngày: trên bề mặt của màng thấy một số nấm mốc và khuẩn lạc xuất hiện.
Bảng 3.2. Khảo sát sự xâm nhiễm của vi sinh vật đối với màng BC đóng gói không tẩm chất phụ gia
Ngày 1 3 5 7
Xuất hiện VSV - - + +
Xuất hiện: + Không xuất hiên: - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 24
Ưu và nhược điểm của phương pháp là:
+ Ưu điểm: Vật liệu dễ kiếm, giá thành rẻ, thao tác đơn giản, dễ thực hiện.
+ Nhược điểm: Không đáp ứng được yêu cầu bảo quản màng trong một thời gian dài, màng dễ bị nhiễm khuẩn.
Vì vậy, phương pháp đóng gói này là không khả thi, không đáp ứng được yêu cầu bảo quản màng BC, ứng dụng trị bỏng.
3.2.2. Đóng gói bằng máy hút chân không
- Vật liệu đóng gói: là túi hút chân không chuyên dụng.
- Phương pháp đóng gói: Được đóng gói bằng máy hút chân không chuyên dụng AMERA V100.
Chúng tôi theo dõi màng BC được đóng gói bằng máy hút chân không trong 30 ngày thì thấy: trên bề mặt của màng BC không thấy xuất hiện nấm mốc và khuẩn lạc.
Bảng 3.3. Khảo sát sự xâm nhiễm của vi sinh vật đối với màng BC đóng gói không tẩm chất phụ gia
Ngày 1 3 5 7 14 30
Xuất hiện VSV - - - - - -
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 25
Ưu nhược điểm của phương pháp: - Ưu điểm:
+ Thao tác không phức tạp.
+ Bảo quản được màng BC trong một khoảng thời gian dài. - Nhược điểm:
+ Phải đầu tư máy và vật liệu đóng gói hút chân không chuyên dụng.
Hình 3.21. Màng BC đóng gói bằng máy hút chân không Hình 3.19. Túi nilon hút
chân không
Hình 3.20. Máy hút chân không AMERA - V100
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 26
Nhận xét: màng BC được đóng gói bằng máy hút chân không có khả năng bảo quản màng BC được lâu hơn phương pháp thông thường.
Như vậy, phương thức đóng gói bằng máy hút chân không phù hợp với đóng gói màng BC ở quy mô phòng thí nghiệm.
3.3. Lựa chọn chất phụ gia bảo quản màng BC khi đóng gói
Chúng tôi tiến hành lựa chọn chất phụ gia bảo quản màng BC khi đóng gói, đồng thời các chất phụ gia này cũng là dung dịch, thuốc hỗ trợ trong quá trình trị bỏng.
Màng sau xử lý được ngâm tẩm trong các dung dịch chất phụ gia theo phương pháp 2.2.5.2 trong thời gian 12 giờ.
Chất phụ gia nghiên cứu: - Nước cất vô trùng
- Dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% - Becberin clorid 0,1%
- Thuốc trị bỏng B76
Chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng thấm hút của màng BC đối với dung dịch các chất phụ gia, độ bền cơ học của màng BC sau khi ngâm tẩm phụ gia. Cụ thể: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.1. Khảo sát khả năng thấm hút của màng BC
Màng BC sau xử lý được sấy khô ở 40oC trong 12h, sau đó được ngâm trong nước cất vô trùng.
3.3.1.1. Khảo sát khả năng thấm hút nước của màng BC
Cân khối lượng màng lần lượt trong các khoảng thời gian 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ để khảo sát khả năng thấm hút.
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 27
Bảng 3.4. Khả năng thấm hút nước của màng sau xử lý (g/100cm2)
Thời gian Thử nghiệm 2h 4h 6h 8h 10h 12h Mẫu 1 0,62 1.85 2,64 3,58 5,12 6,35 Mẫu 2 0,59 2,28 3,32 4,16 4,51 5,89 Mẫu 3 0,58 2,15 3,16 3,53 5,33 5,56 M 0,60 2,09 3,04 3,76 4,99 5,93
Qua bảng 3.4 ta nhận thấy: màng BC có khả năng thấm hút nước tốt. Sau 8 giờ màng hút được 3,76 g/100cm2 nước, sau 12 giờ màng có thể hút tới 5,93 g/100cm2 nước.
3.3.1.2. Khảo sát khả năng thấm hút nước muối sinh lý của màng BC
Nước muối sinh lý (dung dịch NaCl 0,9%) có tác dụng sát khuẩn nhẹ, là dung dịch đẳng trương có áp suất thẩm thấu xấp xỉ với dịch trong cơ thể người.
Khảo sát khả năng thấm hút nước muối sinh lý của màng BC bằng phương pháp tương tự như với nước.
Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.5. Khả năng thấm hút dung dịch nước muối sinh lý của màng BC (g/100cm2)
Thời gian Thử nghiệm
2 giờ 4 giờ 6 giờ 8 giờ 10 giờ 12 giờ
Mẫu 1 2,25 3.08 3,82 3,93 4 4,03
Mẫu 2 2,3 3,15 3,86 3,98 4,15 4,17
Mẫu 3 2,19 2,95 3,71 3,84 3,92 3,98
M 2,25 3,06 3,80 3,92 4,02 4,06
Qua bảng 3.5 ta thấy: sau khi ngâm được 6 giờ màng BC hút được 3,80 g/100cm2 dung dịch nước muối sinh lý, sau 12 giờ hút được 4,06 g/100cm2.
Như vậy, khả năng thấm hút dung dịch nước muối sinh lý của màng BC là tương đối tốt.
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 28
3.3.1.3. Khảo sát khả năng thấm hút thuốc trị bỏng B76 của màng BC
Thuốc trị bỏng B76 do Học viện Quân y sản xuất, có dạng bột, chiết xuất từ vỏ cây xoan trà, có tác dụng chữa các vết bỏng nông, bỏng trung bình và các vết mổ vô trùng, các vết lở loét tay chân, chốc đầu, phỏng dạ.
Màng BC sau xử lý và sấy khô sẽ được ngâm trong dung dịch hòa tan của bột thuốc trị bỏng B76 trong 12 giờ và tiến hành khảo sát độ thấm hút của màng.
Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.6. Khả năng thấm hút thuốc trị bỏng B76 của màng (g/cm2) Thời gian
Thử nghiệm
2 giờ 4 giờ 6 giờ 8 giờ 10 giờ 12 giờ
Mẫu 1 1,56 1,85 2,13 2,39 2,61 2,78 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu 2 1,61 1,90 2,18 2,52 2,73 2,90
Mẫu 3 1,59 1,88 2,15 2,42 2,65 2,83
M 1,59 1,88 2,15 2,44 2,66 2,84
Qua bảng 3.6 ta thấy: sau khi ngâm 6 giờ màng BC hút được 2,15 g/100cm2 dung dịch thuốc trị bỏng B76, sau 12 giờ hút được 2,84 g/100cm2.
Như vậy, màng BC có khả năng thấm hút dung dịch thuốc trị bỏng B76 kém hơn so với hút nước và nước muối sinh lý.
3.3.1.4. Khảo sát khả năng thấm hút Becberin clorid 0,1% của màng BC
Becberin clorid (C20H18ClNO4.2H2O) được triết xuất từ cây vàng đắng là một loại kháng sinh có khả năng sát khuẩn khá cao.
Màng BC sau xử lý và sấy khô sẽ được ngâm trong dung dịch hòa tan của Becberrin clorid 0,1% trong 12 giờ. Qua đó tiến hành khảo sát khả năng thấm hút của màng. Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 29
Bảng 3.7. Khả năng thấm hút Becberin clorid 0,1% của màng(g/100cm2) Thời gian
Thử nghiệm
2 giờ 4 giờ 6 giờ 8 giờ 10 giờ 12 giờ
Mẫu 1 2,95 3,99 4,38 4,46 4,52 4,55
Mẫu 2 3,01 4,05 4,40 4,49 4,54 4,58
Mẫu 3 2,93 3,95 4,33 4,41 4,48 4,52
M 2,96 3,40 4,37 4,45 4,51 4,55
Qua bảng 3.7 ta thấy: sau khi ngâm được 6 giờ màng BC hút được 4,37 g/100cm2 dung dịch Becberin clorid0,1%, sau 12 giờ hút đươc 4,55 g/100cm2.
Như vậy, màng có khả năng thấm hút tốt với dung dịch Becberin clorid 0,1% , thấm hút tốt hơn đối với dung dịch B76 và dung dịch nước muối sinh lý.
So sánh khả năng thấm hút của màng BC đối với các chất phụ gia
Kết quả thể hiện qua đồ thị sau:
0 1 2 3 4 5 6 7 2 4 6 8 10 12 Nước NaCL B76 Becberin clorid M(g/100cm2) t(Giờ)
Đồ thị 3.1. Khả năng thấm hút các chất phụ gia của màng BC
Qua đồ thị 3.1 ta thấy: khả năng thấm hút nước của màng BC là tốt nhất so với khả năng thấm hút các chất phụ gia, sau 12 giờ màng có thể hút được lượng nước là 5,93g/10cm2 . Đối với các chất phụ gia: khả năng màng
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 30
thấm hút Becberin colorid 0,1% là tốt nhất (4,55g/100cm2/12 giờ), tiếp đến là thấm hút nước muối sinh lý (4,06g/100cm2/12 giờ), thấm hút thuốc trị bỏng B76 là kém nhất (2,84g/100cm2/12 giờ).
3.3.2. Khảo sát độ bền cơ học của màng BC sau bảo quản
Các mẫu màng đóng gói bằng máy hút chân không, có tẩm chất phụ gia sau 7 ngày được đưa ra khỏi túi bảo quản để kiểm tra độ bền cơ học theo phương pháp 2.2.2.1, kết quả được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.8. Khảo sát độ bền cơ học của của các mẫu màng BC tẩm chất phụ gia (N/150cm2)
Chiều đo
Mẫu màng Chiều dọc Chiều ngang (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngâm nước 14,7 17,4
NaCl 0,9% 16,4 19,2
B76 17,5 20,8
Becberin clorid 0,1% 17,2 20,5
So sánh độ bền cơ học của các mẫu màngBC tẩm chất phụ gia
Kết quả thể hiện qua đồ thị sau:
0 4 8 12 16 20
Nước cất NaCl 0,9% B76 Becberin
clorid 0,1%
Chiều dọc Chiều ngang
N/150cm2
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 31
Qua bảng 3.8 và đồ thị 3.2 ta thấy độ bền cơ học của màng BC được đóng gói với thuốc trị bỏng B76 (17,5 N/150cm2 theo chiều dọc, 20,8 N/150cm2 theo chiều ngang) và Becberin clorid 0,1% (17,2 N/150cm2 theo chiều dọc, 20,5 N/150cm2 theo chiều ngang) là tốt nhất.
Thông qua việc khảo sát độ thấm hút và độ bền cơ học của màng BC đóng gói với các chất phụ gia ta nhận thấy: màng BC có độ thấm hút tốt nhất với Becberin clorid 0,1% và kém nhất đối với thuốc trị bỏng B76, màng BC tẩm thuốc trị bỏng B76 và Becberin clorid 0,1% có độ bền cơ học tương đương nhau và tốt hơn so với tẩm nước muối sinh lý và màng không tẩm phụ gia.
Như vậy, chúng tôi lựa chọn Becberin clorid 0,1% làm chất phụ gia trong đóng gói, bảo quản màng BC.
3.4. Xây dựng quy trình đóng gói và bảo quản màng BC ở quy mô phòng thí nghiệm thí nghiệm
Bao gồm 6 bước cơ bản:
Bước 1: Xử lý màng
Các bước Cách xử lý Kết quả
1 Rửa lại bằng nước máy nhiều lần Loại bỏ bớt acid acetic
2 Đun với NaOH. O,5N ở 100
0
C trong 30 phút
Màng có màu vàng sậm, mùi hơi khét
3 Trung hoà bằng acid citric loãng Màng từ màu vàng sậm chuyển thành màu trắng
4 Ngâm với NaOH. 0,5N ở nhiệt độ
phòng 12h ( lặp lại 3 lần) Màng BC trắng trong, không mùi
5 Trung hoà bằng acid citric loãng Màng BC trắng trong, không mùi đạt về mặt cảm quan
Bước 2: Diệt khuẩn lần 1 (hấp vô trùng)
Bước 3: Sấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 4: Tẩm Becberin clorid 0,1% trong 12 giờ
Bước 5: Diệt khuẩn lần 2 (chiếu xạ UV)
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 32
Sơ đồ quy trình đóng gói màng BC trong phòng thí nghiệm
Màng BC thu được sau lên
men
Chế phẩm màng BC
- Tẩy rửa: Rửa nhiều lần bằng nước máy
- Loại bỏ acid acetic bằng NaOH - Trung hòa bằng acid citric loãng
Màng BC có màu trắng, không mùi
Hấp vô trùng
Sấy trong 12 giờ ở 400C
Tẩm Berberin clorid 0,1% trong 12 giờ
Đóng gói màng BC bằng máy hút chân không
Bước 4:Tẩm ướp phụ gia
Bước 3: Sấy
Bước 6: Đóng gói
Bước 2: Diệt khuẩn lần 1
Bước 1: Xử lý màng
Chiếu xạ UV
Màng BC sạch khuẩn
Đào Văn Kiên K33B - SP Sinh 33
Quy trình đóng gói màng BC trong phòng thí nghiệm có ưu nhược điểm là:
- Ưu điểm:
+ Quy trình đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm
+ Về cơ bản không làm thay đổi tính chất của màng.
+ Màng BC sau khi đóng gói đáp ứng được các yêu cầu là một màng sinh học ứng dụng trị bỏng.