Đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, micro pipet, cân điện tử, tủ ủ, tủ sấy, tủ hủy, vortex, water bath, que cấy, đèn cồn và các dụng cụ thí nghiệm khác.
3.1.4 Hóa chất, kháng sinh và kháng thể
Hóa chất: nƣớc cất, cồn, NaCl, iodine, đĩa tẩm urea, thuốc thử VP1, VP2, Methyl Red, Kovacs ...
Kháng sinh: Amoxicillin, Ampicillin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Gentamycin, Amikacin, Bactrim (công ty Nam Khoa, Việt Nam).
Kháng thể chuẩn Salmonella O và H (Denka Seiken Co., Ltd., Nhật Bản).
3.1.5 Môi trường
Môi trƣờng: Buffered Peptone Water (BPW; Merck KgaA, Germany), Hajna Tetrathionate Broth (Eiken chemical Co., Ltd., Japan), Manitol Lysine Crystal Violet Brilliant Green Agar (MLCB; Nissui, Japan), Nutrient Agar (NA; Merck KgaA, Germany), Mueller-Hinton Agar (MHA; Merck KgaA, Germany), Nutrient Broth (NB; Oxoid Ltd., England), Tryptic Soy Agar (TSA; Merck KgaA, Germany), Tryptic Soy Broth (TSB; Merck KgaA, Germany), Kligler Iron Agar (KIA; Merck KgaA, Germany), Lysine Indole Motility (LIM; Nissui, Japan), Voges Proskauer (VP; Eiken chemical Co., Ltd., Japan), Simmons’ citrate (Merck KgaA, Germany).
19
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu
Mẫu phân bò đƣợc lấy trên bò nuôi lấy thịt và bò nuôi lấy sữa ở một số trại chăn nuôi và nông hộ tại thành phố Cần Thơ. Mẫu phân đƣợc lấy ngẫu nhiên từ bò khỏe mạnh ở mọi lứa tuổi, phân phải là phân mới, lấy phần phân không tiếp xúc với mặt đất. Mẫu lấy xong đƣợc cho vào bọc nilon vô trùng, ghi thông tin, bảo quản lạnh 2 – 4oC và đem về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ để xử lý.
3.2.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn Salmonella trên phân bò
* Môi trƣờng tiền tăng sinh Buffered Peptone Water (BPW)
Lấy 1g mẫu đem ủ với 9ml môi trƣờng BPW ở 37oC trong vòng 24 giờ.
Ủ mẫu trong môi trƣờng BPW giúp cho Salmonella hồi phục các tổn thƣơng
trong quá trình chuyên chở, giúp phát triển tốt hơn và dễ dàng hơn cho việc nuôi cấy ở các môi trƣờng sau. BPW không có tác dụng tăng trƣởng chọn lọc với các vi khuẩn đƣờng ruột.
* Môi trƣờng tăng sinh Hajna Tetrathionate Broth
Pha dung dịch iodine – potassium iodine vào môi trƣờng Hajna với tỉ lệ 40ml/1000ml.
Dùng micro pipet hút 1ml canh khuẩn tiền tăng sinh cho vào cùng với 9ml môi trƣờng Hajna, đem ủ ở 37oC trong vòng 24 giờ.
Môi trƣờng tăng sinh Hajna kết hợp với dung dịch iodine – potassium iodine sẽ ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gram dƣơng, giúp cho việc tăng sinh vi khuẩn Salmonella.
* Môi trƣờng phân lập Manitol Lysine Crystal Violet Brilliant Green Agar (MLCB)
Là môi trƣờng dạng thạch, vi khuẩn đƣợc cấy trên mặt thạch bằng que cấy sẽ mọc lên trong dạng khuẩn lạc có màu sắc, hình dạng, kích thƣớc khác nhau tùy từng giống vi khuẩn. Môi trƣờng MLCB là môi trƣờng dùng để nuôi cấy
Salmonella.
Dùng que cấy nhúng vào môi trƣờng tăng sinh Hajna, cấy chuyển lên môi trƣờng MLCB. Môi trƣờng này có chất nhuộm Brilliant Green ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn đƣờng ruột gram dƣơng, tạo điều kiện cho Salmonella
20
* Phƣơng pháp xác định khuẩn lạc vi khuẩn Salmonella
Trên môi trƣờng MLCB, khuẩn lạc Salmonella làm môi trƣờng chuyển từ màu tím xanh sang không màu. Khuẩn lạc có màu đen, viền xám nhạt, to, hình tròn đều, bề mặt khuẩn lạc nhô lên, đƣờng kính khoảng 2-4 mm (Curiale, 1990).
Hình 3.1: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trƣờng MLCB
* Làm thuần vi khuẩn
Chọn từ 2 – 3 khuẩn lạc đặc trƣng, tiếp tục ria cấy lại trên môi trƣờng MLCB để làm thuần, sau đó ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
21 Mẫu phân
Cho vào 9ml môi trƣờng tiền tăng sinh BPW
Cho vào 9ml môi trƣờng tăng sinh Hajna
Cấy trên môi trƣờng MLCB
Cấy lại trên môi trƣờng MLCB
Cấy lại trên môi trƣờng NA
Thử sinh hóa: KIA, LIM, VP, Citrate, urea
Hình 3.2: Quy trinh nuôi cấy phân lập vi khuẩn Salmonella (ISO 6579; 2002)
3.2.3 Phương pháp định dạnh vi khuẩn Salmonella bằng phản ứng sinh hóa
Những khuẩn lạc đã đƣợc làm thuần nghi ngờ là Salmonella sẽ đƣợc kiểm tra
các đặc tính sinh hóa trên các môi trƣờng KIA, LIM, VP, Simmons’ citrate, NB + đĩa tẩm urea.
* Môi trƣờng Kligler Iron Agar (KIA)
Môi trƣờng đƣợc dùng để kiểm tra tính sử dụng lên men đƣờng glucose và lactose, tính sinh gas, sinh H2S. Khi cấy vi khuẩn vào môi trƣờng, chúng có thể làm lên men hai loại đƣờng dẫn tới thay đổi pH và làm đổi màu chất chỉ thị phenol red từ đỏ sang vàng. Sự sinh gas sẽ đƣợc kiểm chứng bằng sự sủi bọt khí trên bề mặt thạch hoặc các đƣờng nứt trong cột thạch. Sinh H2S sẽ làm thạch có màu đen.
Dùng que cấy thằng cấy khuẩn lạc xuống phần thạch đứng, ria cấy trên phần thạch nghiêng sau đó đem ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Vi khuẩn Salmonella sử dụng glucose, không sử dụng lactose sẽ làm phần thạch đứng có màu vàng, phần thạch nghiêng có màu đỏ. Đa số các chủng
Salmonella sinh H2S làm xuất hiện màu đen trên thạch.
37oC, 24 giờ 37oC, 24 giờ Chọn khuẩn lạc điển hình Lấy 1 g 37oC, 24 giờ Hút 1 ml 37oC, 24 giờ Chọn khuẩn lạc điển hình 37oC, 24 giờ
22
* Môi trƣờng Lysine Indole Motility (LIM)
Dùng kiểm tra tính sử dụng lysine, tính sinh Indole và tính di động của vi khuẩn. Nếu vi khuẩn có sử dụng lysine sẽ làm môi trƣờng có màu tím nhạt, không sử dụng môi trƣờng có màu nâu. Sự sinh Indole sẽ đƣợc kiểm tra bằng cách nhỏ thuốc thử Kovacs, dƣơng tính sẽ xuất hiện vòng đỏ, âm tính không có vòng đỏ. Vi khuẩn di động sẽ làm đƣờng cấy nhƣ mọc “rễ”.
Dùng que cấy thẳng cắm vi khuẩn vào môi trƣờng, đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó nhỏ thuốc thử Kovacs.
Vi khuẩn Salmonella sử dụng lysine sẽ làm môi trƣờng có màu tím nhạt, không sinh Indole nên không xuất hiện vòng đỏ sau khi nhỏ thuốc thử Kovacs. Xung quanh đƣờng cấy có những hình rễ cây do vi khuẩn Salmonella có tính di động.
* Môi trƣờng Voges Proskauer (VP)
Môi trƣờng dùng để kiểm tra tính sinh acetone của vi khuẩn. Sau khi nhỏ thuốc thử VP1 (alpha-naphthol) và thuốc thử VP2 (potassium hydroxide), nếu trong môi trƣờng có acetone sẽ làm xuất hiện vòng đỏ, ngƣợc lại sẽ không có vòng đỏ.
Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng, ủ ở 37oC trong 24 giờ, sau đó nhỏ thuốc thử VP1 và thuốc thử VP2.
Vi khuẩn Salmonella không sinh acetone nên trong môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ sau khi nhỏ thuốc thử.
* Môi trƣờng Simmons’ citrate
Dùng kiểm tra tính sử dụng citrate nhƣ nguồn carbon duy nhất. Nếu vi khuẩn sử dụng citrate sẽ làm tăng pH của môi trƣờng, lúc này chất chỉ thị màu bromothymol blue có sẵn sẽ làm màu môi trƣờng đổi từ màu xanh lá sang màu xanh dƣơng.
Dùng que cấy thẳng ria vi khuẩn trên bề mặt thạch nghiêng của môi trƣờng. Sau đó đem ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Một số chủng Salmonella có thể sử dụng citrate làm môi trƣờng chuyển sang
màu xanh dƣơng.
* Môi trƣờng Nutrient Broth (NB) có chứa đĩa tẩm urea
Dùng để kiểm tra khả năng phân giải urea của vi khuẩn. Nguồn urea đƣợc cung cấp từ đĩa tẩm urea. Nếu vi khuẩn phân giải urea sẽ làm môi trƣờng có màu đỏ hồng.
23
Vi khuẩn Salmonella không phân giải urea nên không làm môi trƣờng đổi màu.
Hình 3.3: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella
Bảng 3.1: Đặc tính sinh hóa của một số chủng Salmonella (Elmer et al., 2001)
Sinh hóa
Chủng
KIA VP Simmons’
citrate
NB
Glucose Lactose H2S Lysine Di động Citrate Urea
S. Dublin S. Typhimurium S. Enteritidis S. Choleraesuis S. Pullorum S. Gallinarum + + + + + + - - - - - - + + + + - - + + + + + + + + + + - - + + + + + + - - - - - -
3.2.4 Phương pháp định danh các chủng Salmonella bằng phản ứng huyết thanh học
Đây là phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính dựa trên nguyên tắc kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu của vi khuẩn Salmonella.
Xác định kháng nguyên O: khuẩn lạc từ môi trƣờng TSA sẽ đƣợc chọn làm nguồn kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella để định chủng bằng phản ứng
24
ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng thể chuẩn đa giá O. Các loại kháng thể chuẩn đƣợc sản xuất từ Nhật.
Cách tiến hành:
Dùng miếng lam sạch nhỏ một giọt kháng thể ở đầu lam, đầu còn lại nhỏ một giọt nƣớc muối sinh lý. Dùng que cấy chuyển vi khuẩn từ môi trƣờng TSA vào hai giọt kháng thể và nƣớc muối sinh lý, sau đó hòa đều, lắc một phút và quan sát. Nếu dƣơng tính thì giọt kháng thể pha với kháng nguyên có kết tủa nổi trên bề mặt còn giọt kháng thể pha với nƣớc muối sinh lý có màu trắng đục.
Hình 3.4: Phản ứng huyết thanh học của Salmonella với kháng thể chuẩn Nếu có ngƣng kết với kháng nguyên O, ta tiếp tục thực hiện với các nhóm kháng huyết thanh đa giá nhƣ O2; O4; O7; O8; O9; O9,46; O3,10; O1,3,19 … Nếu O không ngƣng kết tiếp tục với O1, hay Vi khi O1 âm tính.
Xác định kháng nguyên H: sau khi xác định đƣợc nhóm kháng nguyên O, kháng nguyên H sẽ đƣợc tiếp tục định chủng dựa theo tiêu chuẩn Popoff and Minor (1997), để định chủng huyết thanh học của các chủng Salmonella phân lập đƣợc.
Cách tiến hành:
Cấy vi khuẩn vào 5ml môi trƣờng TSB ủ ở 37oC/6 – 8h. Làm bất hoạt vi khuẩn bằng 5 ml dung dịch nƣớc muối sinh lý 0,9% có 1% formol, lắc đều.
Phase 1: chia 0,5ml kháng nguyên H vào các ống nghiệm, tƣơng ứng với kháng thể H. Lắc đều hỗn hợp, ủ trong water bath ở 50oC/1h. Đọc kết quả: ống nghiệm vẩn mây là dƣơng tính, có cặn lắng dƣới đáy ông nghiệm là âm tính
1 phút
Dƣơng tính Âm tính Giọt kháng thể chuẩn
Kháng nguyên từ TSA
25
Hình 3.5: Các bƣớc xác định kháng nguyên H phase 1 của Salmonella Phase 2: Nhỏ 1 – 2 giọt kháng thể H phase 1 vào ống nghiệm có 3ml TSB và 0,3% agar, lắc đều. Đặt ống Craigie thẳng đứng vào giữa ống TSB. Khi môi trƣờng đã nguội dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn đã xác định ở phase 1 từ TSA vào trong lòng ống Craigie, ủ ở 37o/24h. Đọc kết quả:
Nếu vi khuẩn mọc bên ngoài ống Craigie: dƣơng tính có kháng nguyên H phase 2 (phase ẩn).
Nếu không có sự di động của vi khuẩn ra ngoài ống Craigie: âm tính, không có kháng nguyên H phase 2.
Sau khi có kết quả định kháng nguyên O, H (cả 2 phase), ta sẽ so với bảng công thức kháng nguyên Salmonella (Bảng 2.1).
Hình 3.6: Các bƣớc xác định kháng nguyên H phase 2 của Salmonella agar
26
3.2.5 Phương pháp kiểm tra tính nhạy cảm của Salmonella đối với một số loại kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán đĩa kháng sinh trên mặt thạch
Dùng phƣơng pháp khuếch tán đĩa kháng sinh để kiểm tra tính nhạy cảm của
Salmonella với một số loại kháng sinh, đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh với nồng
độ thích hợp lên môi trƣờng chuyên dụng đã có vi khuẩn, sau đó đo vòng kháng khuẩn của từng đĩa kháng sinh.
Môi trƣờng chuyên dụng: Mueller-Hinton Agar (MHA). Trong môi trƣờng này có chứa tinh bột là chất hấp thụ độc tố do vi khuẩn thải ra, giảm tác động của chúng tới kháng sinh (Atlas, 2004).
Phương pháp chuẩn bị canh khuẩn
Khuẩn lạc đã xác định là Salmonella đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng NA để
chuẩn bị pha canh khuẩn.
Dùng que cấy thẳng cấy khuẩn lạc từ môi trƣờng NA sang dung dịch nƣớc muối sinh lý, lắc đều. Sau đó lấy so sánh độ đục với độ đục chuẩn trong ống nghiệm có dung dịch chuẩn Mac Farland 0,5. Canh khuẩn có nồng độ 108
tế bào/ml là đạt yêu cầu.
Phương pháp làm kháng sinh đồ
Chuẩn bị môi trƣờng MHA, độ dày thạch khi đổ trên đĩa petri khoảng 4mm là tối ƣu. Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào canh khuẩn và quét đều lên bề mặt thạch môi trƣờng MHA. Sau đó dùng kẹp vô trùng đặt các đĩa kháng sinh đã chuẩn bị trƣớc lên trên bề mặt thạch, mỗi đĩa cách nhau 2,5cm. Đem ủ ở 370C trong 24 giờ.
Phương pháp đọc kết quả
Nếu xung quanh đĩa kháng sinh không có hiện tƣợng trong bề mặt thạch (không có vòng vô khuẩn), vi khuẩn đã kháng với kháng sinh đó.
Nếu xung quanh đĩa có vòng vô khuẩn là nơi vi khuẩn không mọc đƣợc do tác động của kháng sinh. Đo đƣờng kính vòng, tính bằng mm. Sau đó so sánh đƣờng kính vòng vô khuẩn với đƣờng kính chuẩn trong bảng tiêu chuẩn của Viện lâm sàng và xét nghiệm (CSLI, 2011).
27
Hình 3.7: Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Salmonella
Bảng 3.2: Tiêu chuẩn đƣờng kính vòng vô khuẩn của kháng sinh(CSLI, 2011)
Loại kháng sinh Kí hiệu Liều Vòng kháng khuẩn (mm) Nhạy cảm Trung bình Kháng Amoxicillin Ampicillin Ciprofloxacin Norfloxacin Gentamycin Amikacin Bactrim Ax Am Ci Nr Ge Ak Bt 20µg 10µg 5µg 10µg 10µg 30µg 25µg ≥ 18 ≥ 15 ≥ 21 ≥ 17 ≥ 15 ≥ 17 ≥ 16 14 – 17 12 – 14 16 – 20 13 – 16 13 – 14 15 – 16 11 – 15 ≤ 13 ≤ 11 ≤ 15 ≤ 12 ≤ 12 ≤ 14 ≤ 10
3.3Chỉ tiêu theo dõi
Tỉ lệ hiện diện vi khuẩn Salmonella trên bò khỏe theo địa điểm.
Tỉ lệ hiện diện vi khuẩn Salmonella trên bò khỏe theo mục đích sử dụng. Tỉ lệ hiện diện vi khuẩn Salmonella trên bò khỏe theo giống bò.
Tỉ lệ hiện diện vi khuẩn Salmonella trên bò khỏe theo nhóm tuổi.
Tỉ lệ hiện diện vi khuẩn Salmonella trên bò khỏe theo hình thức chăn nuôi. Tỉ lệ các chủng Salmonella phân lập đƣợc.
28
Tỉ lệ nhạy, kháng của Salmonella phân lập đƣợc với một số loại kháng sinh.
3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu đƣợc xử lý thống kê theo phƣơng pháp χ2
bằng phần mềm Minitab 16 có hiệu chỉnh Fisher exact và Yates.
29
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả khảo sát tình hình vệ sinh thú y bò tại Thành phố Cần Thơ
Hình 4.1: Bản đồ Thành phố Cần Thơ (http://stnmt.cantho.gov.vn/map/bdhc2012.png)
Cần Thơ là thành phố trực thuộc Trung ƣơng, nằm ở vị trí trung tâm của vùng đồng bằng sông Cửu Long. Vốn đƣợc mệnh danh là Tây Đô – Thủ phủ của miền Tây Nam bộ từ hơn trăm năm trƣớc, giờ đây Cần Thơ đã trở thành đô thị loại I và là một trong 4 tỉnh thuộc vùng kinh tế trọng điểm của vùng đồng bằng sông Cửu Long và là vùng kinh tế trọng điểm thứ tƣ của Việt Nam. Cần Thơ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới - gió mùa. Khí hậu điều hoà dễ chịu, ít bão, quanh năm nóng ẩm, không có mùa lạnh. Mùa mƣa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 tới tháng 4 năm sau. Địa hình nhìn chung tƣơng đối bằng phẳng, phù hợp cho sản xuất nông, ngƣ nghiệp (http://cantho.gov.vn). Tính đến năm 2011, dân số toàn Thành phố Cần Thơ đạt gần 1.200.300 ngƣời, mật độ dân số đạt 852 ngƣời/km². Cần Thơ là Thành phố hiện đại và lớn nhất vùng hạ lƣu sông Mê Kông. Thành phố Cần Thơ đƣợc chia làm 9 đơn vị hành chính gồm 5 quận và 4 huyện. Quận Ô Môn, quận Cái Răng và quận Bình
30
Thủy đều là những quận có hoạt động chăn nuôi gia súc với nhiều đàn bò đƣợc ngƣời dân chăm sóc (http://vi.wikipedia.org/wiki/Cần_Thơ). Theo niên giám thống kê 2011 (2012) thì tổng đàn bò ở Thành phố Cần Thơ là 3,4 ngàn con, trong đó quận Bình Thủy có 880 con, quận Cái Răng có 370 con, quận Ô Môn có 169 con.
4.1.1 Kết quả khảo sát tình hình vệ sinh thú y bò thịt
Chăn nuôi bò lấy thịt ở Thành phố Cần Thơ chủ yếu do các nông hộ thực hiện. Phần lớn là chăn nuôi nhỏ lẻ, điều kiện chuồng trại, vệ sinh ít đƣợc chú ý đến. Bò đƣợc thả rong trộn lẫn các đàn ở những khu vực có cỏ mọc tự nhiên, làm tăng nguy cơ lây nhiễm bệnh giữa các đàn, bò ăn cỏ là chủ yếu nên năng suất thấp, nguồn nƣớc uống cũng ít đƣợc quan tâm. Bò buổi tối đƣợc cột gần nhà chủ nuôi hoặc ở trong chuồng làm đơn giản bằng cây gỗ che chắn, thức ăn, phân nằm lẫn trên nền đất hoặc cát trong chuồng. Các giống bò thƣờng gặp là