ngƣời
2.15.1 Bệnh thương hàn
Bệnh thƣơng hàn ở ngƣời do vi khuẩn S. Typhi gây ra, có 3 chủng phó thƣơng hàn là S. Enteritidis (Paratyphi A), S. Schottmulleri (Paratyphi B) và S.
Paratyphi C. Tỉ lệ mắc bệnh do thƣơng hàn và phó thƣơng hàn là 10:1. Đây là bệnh nhiễm khuẩn toàn thân, diễn biến rất nặng nếu nhƣ không có biện pháp điều trị tích cực.
Hàng năm trên thế giới có khoảng 21 triệu ngƣời mắc bệnh thƣơng hàn với hơn 200.000 trƣờng hợp tử vong (Crump et al., 2004). Việt Nam có khoảng 10.000 đến 20.000 ca bệnh hàng năm, với hàng chục ca tử vong. Bệnh xảy ra ở nhiều tỉnh dƣới dạng các vụ dịch nhỏ ở đồng bằng sông Cửu Long, ven biển miền Trung, một số tỉnh đồng bằng Bắc bộ và miền núi phía Bắc. Bệnh phổ biến ở các khu kém vệ sinh.
14
Ngƣời bệnh và ngƣời lành mang trùng là ổ chứa chính của bệnh thƣơng hàn. Vi khuẩn có trong phân ngƣời bệnh từ tuần thứ nhất đến hết thời kì lại sức (khoảng 1 - 3 tuần). Khoản 10% bệnh nhân không đƣợc điều trị sẽ thải vi khuẩn qua phân trong vòng 3 tháng. Vi khuẩn thƣơng hàn thƣờng sống trong túi mật và đƣợc đào thải qua phân trong thời gian dài. Đôi khi vật nuôi trong nhà lại là ổ chứa thƣơng hàn.
Ngƣời bị mắc bệnh do dùng thức ăn hoặc uống nƣớc bị nhiễm trực khuẩn thƣơng hàn và phó thƣơng hàn. Những phƣơng thức lây truyền phổ biến là: Uống nƣớc bị nhiễm mầm bệnh (nƣớc lã, nƣớc đá).
Ăn thức ăn bị nhiễm khuẩn thƣơng hàn, nhất là những thức ăn không đƣợc nấu chín nhƣ thịt bò tái … hay có nguồn gốc từ nguồn nƣớc bị nhiễm bệnh nhƣ trai, sò, ốc, hến …
Ăn rau quả đƣợc bón bằng phân tƣơi mà không rửa sạch.
Sữa và các chế phẩm từ sữa bị nhiễm khuẩn từ con vật (bò, dê) hay trong lúc chế biến.
Các loài gặm nhấm hay côn trùng làm lây nhiễm vi khuẩn vào thực phẩm. Triệu chứng lâm sàng thƣờng là sốt tăng dần, rối loạn tiêu hóa, bụng chƣớng, phát ban dạng sởi quanh thắt lƣng. Độc tố thƣơng hàn tác động vào các mảng bạch huyết ở họng và ruột gây ra loét họng, loét ruột, chảy máu ruột. Độc tố cũng gây nhiễm độc thân kinh, nhiễm độc cơ tim gây viêm cơ tim, trụy tim mạch. Nếu bị nhẹ thì gây viêm dạ dày ruột, tiêu chảy.
Chẩn đoán: cấy máu có mọc vi khuẩn thƣơng hàn. Xét nghiệm bằng cách sử
dụng kháng thể đơn dòng phát hiện kháng nguyên H trong máu bệnh nhân.
Điều trị: dùng các thuốc trị vi khuẩn gram âm và cung cấp chất điện giải. Phòng bệnh:
Vaccine TAB (Typhoid Paratyphoid A và B), tiêm dƣới da. Vaccine sống: uống.
Vaccine Vi polysaccharide (Vaccine Vi): tiêm dƣới da.
2.15.2 Ngộ độc thực phẩm do Salmonella
Salmonella là nhân tố hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm trên thế giới (Scallan,
2011). Ngộ độc thực phẩm bởi Salmonella do các chủng Salmonella khác các
chủng gây thƣơng hàn và phó thƣơng hàn trên ngƣời nhƣ S. Typhimuirum, S. Enteritidis… gây ra. Thông thƣờng thì các triệu chứng bắt đầu xuất hiện sau khi bị nhiễm khuẩn 8 - 72 giờ, kéo dài 3 - 5 ngày. Triệu chứng thƣờng gặp là
15
viêm dạ dày ruột, tiêu chảy. Một số triệu chứng khác nhƣ đau bụng, rét run, sốt, buồn nôn, ói mửa, đau khớp… rất khó phân biệt với các bệnh do vi khuẩn đƣờng ruột khác gây ra. Tỉ lệ tử vong thƣờng thấp (< 1%) nhƣng đối với các chủng có độc lực cao nhƣ S. Dublin và S. Choleraesuis thì tử vong với tỉ lệ 20 - 30% do nhiễm trùng máu (Molbak, 2006). Trẻ em, ngƣời già hay ngƣời bị suy giảm chức năng miễn dịch có tỉ lệ nhiễm cao và triệu chứng nặng hơn.
Triệu chứng: theo Bùi Đại, Nguyễn Văn Mùi và Nguyễn Hoàng Tuấn (2002),
triệu chứng lâm sàng khi nhiễm khuẩn, ngộ độc thức ăn do Salmonella gây ra
có ở các thể:
Thể viêm dạ dày và ruột cấp: xuất hiện trung bình 12 – 36 giờ sau khi nhiễm khuẩn, ở thể nhẹ có các triệu chứng nhƣ đi phân lỏng, bụng đau, không sốt. Thể nặng có các hội chứng nhƣ nhiễm khuẩn – nhiễm độc: sốt 38 – 400
C, rét run, nhức đầu mệt mỏi, số lƣợng bạch cầu trong máu ở mức bình thƣờng, hội chứng mất nƣớc – chất điện giải: khát nƣớc, khô môi, mắt trũng, gầy sút, mạch nhanh, nhỏ, huyết áp hạ, thiểu niệu, bụng chƣớng, chuột rút, tay chân lạnh. Bệnh thƣờng tự khỏi sau 2 – 3 ngày, đôi khi phân lỏng đến một tuần. Có thể gây tử vong đối với trẻ nhỏ suy dinh dƣỡng, ngƣời già yếu hoặc biến chứng nhiễm trùng máu.
Thể nhiễm trùng máu: có nhiều điểm giống với thƣơng hàn nhƣng không có tổn thƣơng giải phẫu đặc trƣng của bệnh thƣơng hàn. Triệu chứng lâm sàng nhƣ sốt kéo dài, nhiễm độc thần kinh, bụng chƣớng, gan, lách to … bệnh tiến triển nhanh hơn thƣơng hàn.
Thể khu trú nội tạng: thƣờng nối sau thể viêm ruột, mặc dù không có tiêu chảy sớm. Triệu chứng thƣờng gặp: đốt ngột sốt cao, rét run, sốt dao động, vã mồ hôi, nhiễm độc thần kinh, viêm nhiều cơ quan. Rất khó điều trị.
Thể mang trùng: chỉ phát hiện trong ổ dịch, không có triệu chứng lâm sàng, mang trùng từ 1-3 tuần, có thể tới hai tháng hoặc lâu hơn.
Phòng và điều trị:
Tìm mọi cách đƣa thức ăn nhiễm trùng ra khỏi cơ thể nhƣ rửa dạ dày, gây nôn…
Truyền nƣớc và chất điện giải, cho thuốc trợ tim khi cần thiết.
Ủ ấm ngƣời bệnh, ăn uống theo hƣớng dẫn bác sĩ trong 3 – 5 tuần cho tới khi khỏi bệnh.
Không ăn thức ăn không rõ nguồn gốc, thức ăn chế biến không hợp vệ sinh hay thức ăn đã bị hƣ hỏng.
16
2.16 Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella
Mặc dù Salmonella có nhiều nguồn để lây lan nhƣ môi trƣờng, nƣớc, phƣơng
tiện chuyên chở, thú nuôi, bò sát… nhƣng hơn 95% trƣờng hợp lây nhiễm là từ nguồn thực phẩm bị nhiễm khuẩn, trong đó có sản phẩm động vật (McLaughlin
et al., 2006). Do đó, phòng chống lây nhiễm Salmonella từ động vật sang
ngƣời là vấn đề cần quan tâm.
Gần đây, sự kháng kháng sinh của vi khuẩn đã trở thành một vấn đề nghiêm trọng trên thể giới, ở cả thuốc thú y và thuốc nhân y. Những vi khuẩn kháng thuốc ở động vật có thể đƣợc truyền qua ngƣời theo đƣờng ăn uống hoặc lây nhiễm (Lathers, 2001), trong đó có Salmonella.
Việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh và chất kích thích tăng trƣởng trong chăn nuôi đã góp làm gia tăng nhanh chóng tính kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella. Những kháng sinh truyền thống dùng để diệt Salmonella
nhƣ Ampicillin, Chloramphenicol, Trimethoprim/Sulfamethoxazole đang dần bị hạn chế hiệu quả (Angulo et al., 2000). Các kháng sinh khác nhƣ
Fluoroquinolones và Cephalosporins phổ rộng đang đƣợc dùng thay thế, tuy nhiên một số Salmonella có thể kháng Cephalosporins phổ rộng đã đƣợc phân
lập từ ngƣời và bò (Dunne et al., 2000; Fey et al., 2000).
Nguy cơ truyền tính kháng kháng sinh của Salmonella từ động vật qua ngƣời cũng đáng quan tâm: Fey et al. (2000), đã phân lập đƣợc vi khuẩn Salmonella kháng Ceftriaxone từ một đứa bé nhiễm khuẩn thông qua việc tiếp xúc với bò. Dunne et al. (2000), chỉ ra rằng chủng Salmonella kháng Ceftriaxone đang
xuất hiện trên ngƣời ở Hoa Kỳ.
Theo nghiên cứu của Margaret et al. (2011), Salmonella phân lập từ bò ở bang Dakota (Hoa Kỳ) đã kháng với Amoxicillin/Clavulanic acid (94,8%), Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfizoxazone, Tetracyline (đều 94,7%).
Nghiên cứu trong nƣớc ở các chủng Salmonella gây thƣơng hàn cho ngƣời tại
các thành phố Hà Nội, Thanh Hóa, Huế, Hồ Chí Minh của Lê Huy Chính (2000), cho thấy:
+ Tác nhân gây dịch thƣơng hàn đã kháng thuốc là S. Typhi (97,8%), các chủng phó thƣơng hàn rất ít gặp.
+ Vi khuẩn thƣơng hàn kháng 4 kháng sinh thƣờng dùng trong điều trị là Chloramphenicol, Ampicillin, Co-trimoxazole và Tetracyclin là từ 83,1% tới 91,8% và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao gấp 32 – 64 lần giới hạn đề kháng.
17
Để hạn chế mức độ kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella, cần giảm việc dùng kháng sinh trong chăn nuôi và sử dụng các biện pháp thay thế kháng sinh.
18
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện từ tháng 08/2013 tới tháng 12/2013.
Địa điểm lấy mẫu: mẫu phân đƣợc lấy ở trại và nông hộ chăn nuôi bò tại thành phố Cần Thơ.
Địa điểm thực hiện: mẫu phân đƣợc phân tích ở phòng Vệ sinh thực phẩm của Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Đối tượng nghiên cứu
Phân bò nuôi lấy thịt và bò sữa không bệnh lý ở mọi lứa tuổi lấy từ trại chăn nuôi và nông hộ tại thành phố Cần Thơ.
3.1.3 Dụng cụ và trang thiết bị
Đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, micro pipet, cân điện tử, tủ ủ, tủ sấy, tủ hủy, vortex, water bath, que cấy, đèn cồn và các dụng cụ thí nghiệm khác.
3.1.4 Hóa chất, kháng sinh và kháng thể
Hóa chất: nƣớc cất, cồn, NaCl, iodine, đĩa tẩm urea, thuốc thử VP1, VP2, Methyl Red, Kovacs ...
Kháng sinh: Amoxicillin, Ampicillin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Gentamycin, Amikacin, Bactrim (công ty Nam Khoa, Việt Nam).
Kháng thể chuẩn Salmonella O và H (Denka Seiken Co., Ltd., Nhật Bản).
3.1.5 Môi trường
Môi trƣờng: Buffered Peptone Water (BPW; Merck KgaA, Germany), Hajna Tetrathionate Broth (Eiken chemical Co., Ltd., Japan), Manitol Lysine Crystal Violet Brilliant Green Agar (MLCB; Nissui, Japan), Nutrient Agar (NA; Merck KgaA, Germany), Mueller-Hinton Agar (MHA; Merck KgaA, Germany), Nutrient Broth (NB; Oxoid Ltd., England), Tryptic Soy Agar (TSA; Merck KgaA, Germany), Tryptic Soy Broth (TSB; Merck KgaA, Germany), Kligler Iron Agar (KIA; Merck KgaA, Germany), Lysine Indole Motility (LIM; Nissui, Japan), Voges Proskauer (VP; Eiken chemical Co., Ltd., Japan), Simmons’ citrate (Merck KgaA, Germany).
19
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu
Mẫu phân bò đƣợc lấy trên bò nuôi lấy thịt và bò nuôi lấy sữa ở một số trại chăn nuôi và nông hộ tại thành phố Cần Thơ. Mẫu phân đƣợc lấy ngẫu nhiên từ bò khỏe mạnh ở mọi lứa tuổi, phân phải là phân mới, lấy phần phân không tiếp xúc với mặt đất. Mẫu lấy xong đƣợc cho vào bọc nilon vô trùng, ghi thông tin, bảo quản lạnh 2 – 4oC và đem về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ để xử lý.
3.2.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn Salmonella trên phân bò
* Môi trƣờng tiền tăng sinh Buffered Peptone Water (BPW)
Lấy 1g mẫu đem ủ với 9ml môi trƣờng BPW ở 37oC trong vòng 24 giờ.
Ủ mẫu trong môi trƣờng BPW giúp cho Salmonella hồi phục các tổn thƣơng
trong quá trình chuyên chở, giúp phát triển tốt hơn và dễ dàng hơn cho việc nuôi cấy ở các môi trƣờng sau. BPW không có tác dụng tăng trƣởng chọn lọc với các vi khuẩn đƣờng ruột.
* Môi trƣờng tăng sinh Hajna Tetrathionate Broth
Pha dung dịch iodine – potassium iodine vào môi trƣờng Hajna với tỉ lệ 40ml/1000ml.
Dùng micro pipet hút 1ml canh khuẩn tiền tăng sinh cho vào cùng với 9ml môi trƣờng Hajna, đem ủ ở 37oC trong vòng 24 giờ.
Môi trƣờng tăng sinh Hajna kết hợp với dung dịch iodine – potassium iodine sẽ ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gram dƣơng, giúp cho việc tăng sinh vi khuẩn Salmonella.
* Môi trƣờng phân lập Manitol Lysine Crystal Violet Brilliant Green Agar (MLCB)
Là môi trƣờng dạng thạch, vi khuẩn đƣợc cấy trên mặt thạch bằng que cấy sẽ mọc lên trong dạng khuẩn lạc có màu sắc, hình dạng, kích thƣớc khác nhau tùy từng giống vi khuẩn. Môi trƣờng MLCB là môi trƣờng dùng để nuôi cấy
Salmonella.
Dùng que cấy nhúng vào môi trƣờng tăng sinh Hajna, cấy chuyển lên môi trƣờng MLCB. Môi trƣờng này có chất nhuộm Brilliant Green ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn đƣờng ruột gram dƣơng, tạo điều kiện cho Salmonella
20
* Phƣơng pháp xác định khuẩn lạc vi khuẩn Salmonella
Trên môi trƣờng MLCB, khuẩn lạc Salmonella làm môi trƣờng chuyển từ màu tím xanh sang không màu. Khuẩn lạc có màu đen, viền xám nhạt, to, hình tròn đều, bề mặt khuẩn lạc nhô lên, đƣờng kính khoảng 2-4 mm (Curiale, 1990).
Hình 3.1: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trƣờng MLCB
* Làm thuần vi khuẩn
Chọn từ 2 – 3 khuẩn lạc đặc trƣng, tiếp tục ria cấy lại trên môi trƣờng MLCB để làm thuần, sau đó ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
21 Mẫu phân
Cho vào 9ml môi trƣờng tiền tăng sinh BPW
Cho vào 9ml môi trƣờng tăng sinh Hajna
Cấy trên môi trƣờng MLCB
Cấy lại trên môi trƣờng MLCB
Cấy lại trên môi trƣờng NA
Thử sinh hóa: KIA, LIM, VP, Citrate, urea
Hình 3.2: Quy trinh nuôi cấy phân lập vi khuẩn Salmonella (ISO 6579; 2002)
3.2.3 Phương pháp định dạnh vi khuẩn Salmonella bằng phản ứng sinh hóa
Những khuẩn lạc đã đƣợc làm thuần nghi ngờ là Salmonella sẽ đƣợc kiểm tra
các đặc tính sinh hóa trên các môi trƣờng KIA, LIM, VP, Simmons’ citrate, NB + đĩa tẩm urea.
* Môi trƣờng Kligler Iron Agar (KIA)
Môi trƣờng đƣợc dùng để kiểm tra tính sử dụng lên men đƣờng glucose và lactose, tính sinh gas, sinh H2S. Khi cấy vi khuẩn vào môi trƣờng, chúng có thể làm lên men hai loại đƣờng dẫn tới thay đổi pH và làm đổi màu chất chỉ thị phenol red từ đỏ sang vàng. Sự sinh gas sẽ đƣợc kiểm chứng bằng sự sủi bọt khí trên bề mặt thạch hoặc các đƣờng nứt trong cột thạch. Sinh H2S sẽ làm thạch có màu đen.
Dùng que cấy thằng cấy khuẩn lạc xuống phần thạch đứng, ria cấy trên phần thạch nghiêng sau đó đem ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Vi khuẩn Salmonella sử dụng glucose, không sử dụng lactose sẽ làm phần thạch đứng có màu vàng, phần thạch nghiêng có màu đỏ. Đa số các chủng
Salmonella sinh H2S làm xuất hiện màu đen trên thạch.
37oC, 24 giờ 37oC, 24 giờ Chọn khuẩn lạc điển hình Lấy 1 g 37oC, 24 giờ Hút 1 ml 37oC, 24 giờ Chọn khuẩn lạc điển hình 37oC, 24 giờ
22
* Môi trƣờng Lysine Indole Motility (LIM)
Dùng kiểm tra tính sử dụng lysine, tính sinh Indole và tính di động của vi khuẩn. Nếu vi khuẩn có sử dụng lysine sẽ làm môi trƣờng có màu tím nhạt, không sử dụng môi trƣờng có màu nâu. Sự sinh Indole sẽ đƣợc kiểm tra bằng cách nhỏ thuốc thử Kovacs, dƣơng tính sẽ xuất hiện vòng đỏ, âm tính không có vòng đỏ. Vi khuẩn di động sẽ làm đƣờng cấy nhƣ mọc “rễ”.
Dùng que cấy thẳng cắm vi khuẩn vào môi trƣờng, đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó nhỏ thuốc thử Kovacs.
Vi khuẩn Salmonella sử dụng lysine sẽ làm môi trƣờng có màu tím nhạt, không sinh Indole nên không xuất hiện vòng đỏ sau khi nhỏ thuốc thử Kovacs. Xung quanh đƣờng cấy có những hình rễ cây do vi khuẩn Salmonella có tính di động.
* Môi trƣờng Voges Proskauer (VP)
Môi trƣờng dùng để kiểm tra tính sinh acetone của vi khuẩn. Sau khi nhỏ thuốc thử VP1 (alpha-naphthol) và thuốc thử VP2 (potassium hydroxide), nếu trong môi trƣờng có acetone sẽ làm xuất hiện vòng đỏ, ngƣợc lại sẽ không có vòng đỏ.
Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng, ủ ở 37oC trong 24 giờ, sau đó nhỏ thuốc thử VP1 và thuốc thử VP2.
Vi khuẩn Salmonella không sinh acetone nên trong môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ sau khi nhỏ thuốc thử.
* Môi trƣờng Simmons’ citrate
Dùng kiểm tra tính sử dụng citrate nhƣ nguồn carbon duy nhất. Nếu vi khuẩn sử dụng citrate sẽ làm tăng pH của môi trƣờng, lúc này chất chỉ thị màu bromothymol blue có sẵn sẽ làm màu môi trƣờng đổi từ màu xanh lá sang màu xanh dƣơng.
Dùng que cấy thẳng ria vi khuẩn trên bề mặt thạch nghiêng của môi trƣờng. Sau đó đem ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Một số chủng Salmonella có thể sử dụng citrate làm môi trƣờng chuyển sang
màu xanh dƣơng.
* Môi trƣờng Nutrient Broth (NB) có chứa đĩa tẩm urea
Dùng để kiểm tra khả năng phân giải urea của vi khuẩn. Nguồn urea đƣợc cung cấp từ đĩa tẩm urea. Nếu vi khuẩn phân giải urea sẽ làm môi trƣờng có màu đỏ hồng.
23
Vi khuẩn Salmonella không phân giải urea nên không làm môi trƣờng đổi màu.
Hình 3.3: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella
Bảng 3.1: Đặc tính sinh hóa của một số chủng Salmonella (Elmer et al., 2001)
Sinh hóa
Chủng
KIA VP Simmons’
citrate
NB
Glucose Lactose H2S Lysine Di động Citrate Urea
S. Dublin S. Typhimurium S. Enteritidis S. Choleraesuis S. Pullorum S. Gallinarum + + + + + + - - - - - - + + + + - - + + +