7 Cao Bằng CB Bảo Lạc – Cao Bằng
2.2.2.2. Phương pháp giải trình tự ADN cá Bỗng
Phương pháp tách chiết ADN bằng bộ kít QIAGEN.
Quy trình tách chiết ADN bằng bộ kít Qiagen được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất và được tiến hành tại phòng Công nghệ Sinh học – Trường Cao đẳng Thủy Sản – Từ Sơn – Bắc Ninh.
Phương pháp điện di ADN tổng số.
Chuẩn bị 25 ml Agarose với nồng độ 1%:
Đong 25 ml dung dịch TBE 1X vào lọ, cân 25 g Agarose cho vào và đun trên lò vi sóng cho tan hoàn toàn đưa ra ngoài khi nhiệt độ lớn hơn 55oC cho thêm 1,25 gelred và lắc đều không để tạo bọt, để nguội khoảng 55oC sau
đó đổ dung dịch vào khuôn gel có cài sẵn lược để tạo các giếng, chờ cho đông lại( xuất hiện màu đục).
Bỏ tấm lược ra và đặt gel vào buồng điện di có chứa dung dịch TBE 1X.
Tra mẫu vào giếng:
Mẫu gồm 3 ADN và 1 Loading dye, hỗn hợp được trộn đều sau đó dùng pipet hút mẫu nạp vào các giếng.
Chạy điện di:
Điều chỉnh hiệu điện thế 220 V, cường độ dòng điện 110 mA và tiến hành trong khoảng 30 phút. Khi vạch chạy đến 2/3 bản gel thì dừng lại, mang bản gel sau khi chạy điện di quan sát dưới đèn UV.
Kỹ thuật PCR để nhân đại đoạn gen 16S và gen COI.
Đoạn gien 16S và COI của ADN ty thể cá Bỗng được khuếch đại bằng sử dụng cặp mồi được trình bày ở Bảng 2.3. Hỗn hợp tạo phản ứng PCR sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi phản ứng PCR được thực hiện với thể tích 25 µl (Nước tinh khiết 4,2 µl, Top taq Maxter mix 12,5µl, primers 2µl, ADN khuôn mẫu 1µl).
Bảng 2.3. Các cặp mồi được sử dụng để giải trình tự ADN của cá Bỗng Gen Mồi Trình tự mồi (5'-3') Tài liệu tham khảo
16S
16Sp1F CTT ACA CCG AGA ARA CAT C
Li et al [55]
16Sp1R CTT AAG CTC CAA AGG GTC
COI
COI-L5956 CACAAAGACATTGGCACCCT
Miya & Nishida [59]
COI- H6855 AGTCAGCTGAAKACTTTTAC
Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR nhân bản vùng gen 16S và COI: 94o C trong 3 phút, tiếp theo 30 chu kỳ (94oC 30 giây, nhiệt độ gắn mồi 560C 30 giây, và 72oC trong 1 phút), kéo dài đoạn 72oC trong 10 phút. Sản phẩm PCR được làm sạch bằng QIAGEN QIAquick PCR Kit. Phương pháp làm sạch sản
phẩm PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose/TAE 2%.
Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR.
Chuẩn bị 25 ml Agarose với nồng độ 2%:
Đong 25 ml dung dịch TBE 1X vào lọ, cân 50g Agarose cho vào và đun trên lò vi sóng cho tan hoàn toàn đưa ra ngoài khi nhiệt độ lớn hơn 55oC cho thêm 1,25 gelred và lắc đều không để tạo bọt, để nguội khoảng 50oC sau đó đổ dung dịch vào khuôn gel có cài sẵn lược để tạo các giếng, chờ cho đông lại (xuất hiện màu đục).
Bỏ tấm lược ra và đặt gel vào buồng điện di có chứa dung dịch TBE 1X.
Cho mẫu vào giếng:
Mẫu gồm 3 ADN và 1 loading dye, hỗn hợp được trộn đều sau đó dùng pipet hút mẫu nạp vào các giếng.
Chạy điện di:
Điều chỉnh hiệu điện thế 220 V, cường độ dòng điện 110 mA và tiến hành trong khoảng 30 phút. Khi vạch chạy đến 2/3 bản gel thì dừng lại, mang bản gel sau khi chạy điện di quan sát dưới đèn UV. Kết quả điện di cho các vạch gọn, phân tách rõ ràng là ADN trong mẫu đã tinh sạch cho nghiên cứu tiếp.
Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR.
Sản phẩm PCR được làm sạch bằng QIAGEN QIAquick PCR Kit. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose/TAE 2%. Tiếp theo trình tự ADN được giải theo phương pháp của ABI 3130XL, mỗi mẫu được giải trình tự bằng 2 mồi xuôi và ngược.
Bước 1. Thêm 100 Buffer vào sản phẩm PCR với tỉ lệ (5 : 1) PB : PCR
Bước 2. Tiến hành hút tất cả dung dịch vào ống đầu lọc đã được
chuẩn bị sẵn.
Bước 3. Li tâm 1 phút với tốc độ 1300 vòng/ 1 phút,loại bỏ ống dưới
và lấy ống cọt lọc.
Bước 4. Thêm 750 Buffer BE vào cột lọc và tiến hành li tâm 13000
vòng/1 phút trong thời gian 1 phút.
Bước 5. Loại bỏ nước ở phía dưới, lắp cột lọc vào ống Eppandoss 1,5
và đánh dấu theo tỉ lệ như ống cũ.
Bước 6. Thêm 30 Buffer EB vào chính giữa màng cột lọc ( tránh không
để chạm vào màng lọc) để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó mang li tâm 13000 vòng/1 phút trong thời gian 1 phút.
Bước 8. Kiểm tra sản phẩm trên Agarose.