2. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.10. Phương pháp xác ựịnh hiệu giá kháng thể Gumboro và Viêm phế quản truyền nhiễm trong huyết thanh của gà sau khi sử dụng vacxin bằng phản ứng
truyền nhiễm trong huyết thanh của gà sau khi sử dụng vacxin bằng phản ứng ELISA
- Chuẩn bị nguyên liệu:
đĩa gắn kháng nguyên virus Gumboro, các dung dịch pha loãng mẫu huyết thanh, cơ chất, dung dịch dừng phản ứng, conjugate, ựối chứng huyết thanh dương tắnh và âm tắnh là các chất ựã ựược pha chế sẵn có trong bộ kit.
Dung dịch rửa ựặc 10 lần (10x): Khi sử dụng pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần và bảo quản ở nhiệt ựộ 40C/ 3 ngày hoặc ở tủ lạnh âm (-200C)/ 1 năm.
Chuẩn bị mẫu kiểm tra: Huyết thanh của gà lấy tại các thời ựiểm kiểm tra ựược vô hoạt bổ thể ở 560C/ 30 phút và bảo quản ở nhiệt ựộ (≤- 200C)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44 250C) trong 1 giờ trước khi làm phản ứng.
Tiến hành phản ứng
2.4.10.1. Kiểm tra kháng thể Gumboro bằng phản ứng ELISA (kit của hãng INDEXX Ờ Mỹ)
Pha huyết thanh với dung dịch pha loãng mẫu thành tỷ lệ 1:500.
Cho 100 ộl dung dịch ựối chứng âm vào giếng A1, 100 ộl dung dịch ựối chứng dương vào giếng B1 và 100 ộl dung dịch huyết thanh ựã pha loãng vào mỗi giếng của ựĩa nhựa 96 giếng.
để ở nhiệt ựộ phòng trong thời gian 30 phút.
Rửa ựĩa bằng nước rửa, 3 lần. Thể tắch rửa mỗi giếng là 350 ộl /lần và làm khô các giếng.
Cho 100 ộl kháng kháng thể (kháng thể ựã gắn enzym) vào mỗi giếng. để ở nhiệt ựộ phòng trong thời gian 30 phút.
Rửa ựĩa bằng nước rửa 3 lần và làm khô ựĩa.
Cho 100 ộl cơ chất phù hợp với enzym vào mỗi giếng và ựể trong bóng tối trong thời gian 15 phút.
Cho 100 ộl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng.
Cho ựĩa phản ứng vào máy ựọc ELISA ở bước sóng 650 ηm - đọc kết quả:
Phản ứng (-) tắnh: S/P ≤ 0.2 Phản ứng (+) tắnh: S/P > 0.2
Hiệu giá chuẩn ựộ ELISA kháng thể Gumboro ựược tắnh theo công thức: Log10ỘHiệu giá chuẩn ựộỢ = 1,09 (log10 S/P) + 3.36 = A
Hiệu giá chuẩn ựộ kháng thể Gumboro = 10A
2.4.10.2. Kiểm tra kháng thể IB bằng phản ứng ELISA (kit của hãng Synbiotic)
Nhỏ 50 ộl dung dịch pha loãng mẫu vào các giếng ựối chứng và giếng cần kiểm tra mẫu.
Nhỏ 50 ộl huyết thanh ựối chứng dương vào giếng A1, A3 và H11.
Sử dụng pipet ựa kênh (8 Ờ 12 kênh) chuyển các mẫu huyết thanh ựã pha loãng vào các giếng tương ứng của ựĩa phản ứng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45 Rửa ựĩa bằng nước rửa 3 lần, thể tắch rửa mỗi giếng là 300 ộl /lần và làm khô các giếng.
Cho 100 ộl kháng kháng thể (kháng thể ựã gắn enzim - Anti chicken) vào mỗi giếng.
để ở nhiệt ựộ phòng trong thời gian 30 phút. Rửa ựĩa bằng nước rửa 3 lần và làm khô ựĩa.
Cho 100 ộl Substrate (cơ chất phù hợp với enzim) vào mối giếng và ựể trong bóng tối trong thời gian 15 phút.
Cho 100 ộl dung dịch dừng phản ứng (Stop solution) vào mỗi giếng. Cho ựĩa phản ứng vào máy ựọc ELISA ở bước sóng 405 Ờ 410 ηm. - đọc kết quả:
Phản ứng (+) tắnh: S/P > 0,15. Phản ứng (-) tắnh: S/P ≤ 0,15.