Bước 1 Chuẩn bị trước khi tiến hành phản ứng
Chuẩn bị phiến kính
Mỗi mẫu huyết thanh cần dùng 3 phiến kính, mỗi phiến kính chia làm 8 ô, mỗi ô dùng cho một chủng kháng nguyên, những phiến kính này phải thật sạch, không mốc, không bị xước, trước khi dùng phải dùng bông tẩm cồn lau sạch sau đó để khô.
Kiểm tra kháng nguyên
Kiểm tra kháng nguyên bằng mắt thường: soi từng ống nghiệm chứa kháng nguyên lên trước nguồn sáng, nếu thấy kháng nguyên trong, không có kết tủa, khi lắc nhẹ nó vẩn đục như làn khói là những chủng mọc tốt.
Kiểm tra huyết thanh bằng kính hiển vi: lắc đều từng ống kháng nguyên, pha loãng kháng nguyên với dung dịch đệm bằng cách cho thêm vào từng ống kháng nguyên 2ml dung dịch đệm, lắc đều, sau đó nhỏ lần lượt từng chủng kháng nguyên lên phiến kính xem qua kính hiển vi tụ quang nền đen, kháng nguyên đạt yêu cầu phải mọc tốt, phân tán đều trong môi trường (Theo hướng dẫn của viện Pasteur Tp.Hồ Chí Minh).
Chuẩn bị huyết thanh
Huyết thanh nếu dự trữ lạnh thì rã đông trong 30 phút, đưa lên máy lắc ống trộn đều, sau đó bắt đầu pha loãng với hiệu giá pha loãng khởi đầu là 1: 50 (100µl huyết thanh với 4900 µl dung dịch đệm).
22 100 µl huyết thanh
4900 µl dung dịch đệm
Huyết thanh Huyết thanh đã pha loãng 1: 50 Hình 3.2 Sơ đồ pha loãng huyết thanh Hình 5 Bước 2 Tiến hành phản ứng vi ngưng kết
Trên mỗi ô của đĩa nhựa ta dùng pipet hút 50µl huyết thanh đã pha loãng ở nồng độ 1:50, nhỏ lần lượt vào mỗi ô, sau đó dùng pipet hút 50µl kháng nguyên vào 24 ô huyết thanh, mỗi ô một chủng tương ứng 24 chủng kháng nguyên. Dùng mỗi đầu pipet cho một mẫu huyết thanh và mỗi chủng kháng nguyên. Sau đó lắc nhẹ, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 1 giờ hoặc ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ.
Hút một giọt ở mỗi ô nhỏ lên phiến kính. Đọc kết quả dưới kính hiển vi nền đen có độ phóng đại 10 lần. Lần lượt quan sát kết quả ở 24 ô tương ứng với 24 chủng kháng nguyên.
Bước 3 Tiến hành đối chứng âm
Trên mỗi ô của đĩa nhựa nhỏ 50µl dung dịch đệm và 50µl kháng nguyên sống tương ứng với 1 chủng Leptospira. Dưới kính hiển vi nền đen Leptospira xuất hiện trên vi trường, không tự ngưng kết và chuyển động tốt.
23
Bước 4 Đánh giá kết quả
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC380950/?pageindex=5#page)
Hình 3.3Các mức độ ngưng kết trong phản ứng vi ngưng kết (MAT)Hìn
Dưới kính hiển vi nền đen với độ phóng đại 10 lần, mức độ ngưng kết được ghi nhận như sau:
- Âm tính (-): xoắn khuẩn không ngưng kết, di động tự do như đối chứng âm. - Dương tính (+): trên vi trường xuất hiện những cụm hay mảng ngưng kết trắng đục, rìa có tua do xoắn khuẩn Leptospira dính vào, số Leptospira tự do ít so với đối chứng âm. Dựa vào mức độ ngưng kết để đánh giá kết quả dương tính.
+ + + +: Tất cả Leptospira ngưng kết, cụm ngưng kết lớn, không có xoắn khuẩn tự do.
+ + +: Trên 75% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, ít xoắn khuẩn tự do. + +: Từ 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, có 1/2 số xoắn khuẩn tự do.
+: Từ 25% đến dưới 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, nhiều xoắn khuẩn tự do Theo Carter (1984), quy định mức ngưng kết 50% (++) ở hiệu giá lớn hơn hoặc bằng 1:200 là dương tính, 1: 100 là nghi ngờ. Đối với những thú đã được tiêm phòng thì mức hiệu giá ngưng kết 1:1000 mới được gọi là dương tính.
24
Bước 5 Nâng cao hiệu giá
Đối với mẫu huyết thanh xét nghiệm ở mức 2+, 3+, 4+ thì tiếp tục nâng hiệu giá pha loãng huyết thanh lên 1:100, 1:200, 1:400,..cho đến khi phản ứng ngưng kết âm tính hoặc dương tính nhưng mức độ ngưng kết ở dưới mức 2+ thì mẫu huyết thanh hoàn tất.
Cách pha loãng huyết thanh: lấy 1ml huyết thanh ở nồng độ 1: 50 pha với 1ml dung dịch đệm, ta có độ pha loãng 1:100. Tương tự như vậy, pha loãng huyết thanh đến mức cần thiết. 1ml dung dịch đệm 1ml Huyết thanh 1: 100 1: 200 1: 400 … 1: 1600 đã pha loãng 1: 50
Hình 3.4 Sơ đồ nâng cao hiệu giá huyết thanh Hình 6