Ở Việt Nam, bệnh được Vaucel phát hiện lần đầu vào năm 1934. Tiếp đó nhiều ổ dịch xảy ra ở Hà Nội, Hải Phòng, Phú Thọ. Đến năm 1937 tại Tuyên Quang Vaucel đã phân lập được mầm bệnh. Năm 1978, Viện Thú y trung ương đã điều tra ở Quảng Ninh, Lào Cai, Nghệ An, Yên Bái. Tỷ lệ dương tính với Leptospira lần lượt là: bò 38%, trâu 35,1%, heo 22,9%, chó 26,47%, công nhân chăn nuôi 56% (Nguyễn Như Thanh, 1997).
Lê Huỳnh Thanh Phương (2001) đã nghiên cứu tình hình nhiễm Leptospira
trên chó tại một số địa phương miền Bắc Việt Nam. Kết quả có 437 mẫu dương tính trong tổng số 1729 chiếm tỷ lệ 25,3%. Các serovar có tỷ lệ nhiễm cao là L. bataviae, L. canicola, L. icteroheamorrhagiae, L. grippotyphosa.
Hoàng Mạnh Lâm và ctv, (2002) kiểm tra 273 mẫu huyết thanh trên chó lấy từ 3 vùng sinh thái khác nhau của tình Đaklak bằng phương pháp vi ngưng trên phiến kính (MAT), sử dụng kháng nguyên sống gồm 14 serovar Leptospira.
Kết quả có 54 mẫu dương tính, chiếm tỷ lệ 19,8% với 6 serovar Leptospira. Các serovar Leptospira chiếm tỷ lệ cao: L. pyrogenes (35,2%), L sejroe
(20,37%), L. mini (18,52%). Có 3 serovar mới phát hiện là L. pyrogenes, L. mini, L. javanica. Hiệu giá ngưng kết từ cao nhất ở 1 :800 (46,3%).
Nguyễn Thị Bé Mười (2008) khảo sát trên 300 chó ở Thành Phố Cần Thơ. Kết quả có 23 mẫu dương tính chiếm 21,3% với 10 serovar Leptospira. Các serovar chiếm tỷ lệ cao L. hustbridge (36,69%), L .icterohaemorrhagiae
(17,16%), L. bataviae (13,61%). Chó nhiễm 1 serovar cao nhất (61%), nhiều nhất ở nhóm tuổi 1-3 năm. Điều trị chó dương tính bằng Oxytetracycline 10% giảm kháng khuẩn 100%, đối với Streptomycin chỉ làm giảm 75%.
Nguyễn Văn Nhã (2010), kiểm tra huyết thanh chó quanh khu vực trại chăn nuôi của công ty cổ phần thuỷ sản Sông Hậu bằng phản ứng vi ngưng kết (MAT). Tỷ lệ chó dương tính 40,48% ở 11/23 serovar Leptospira. Mức hiệu giá ngưng kết tập trung chủ yếu 1/100. Các chủng chiếm phổ biến:
L.icterohaemorrhagiae Tonkini LT9668 (22,7%), L. australis australis Ballico
(18,2%). L canicola canicola chiffon (18,18%).
Võ Thành Thìn và ctv, (2012) sử dụng phương pháp vi ngưng kết trên phiến kính (MAT), đã xác định được tỷ lệ nhiễm Leptospira trên đàn lợn nái tại Khánh Hòa là 17,7%. Trong đó, các serovar chiếm ưu thế là pomona (51,2%), tiếp theo là panama (19,5%), icterohaemorrhagiae (14,6%), autumnalis
(12,2%.
Võ Lê Chi (2012), ứng dụng phương pháp PCR trên 100 mẫu DNA tách chiết từ thận lợn cho kết quả dương tính với Leptospira là 11 mẫu với tỷ lệ nhiễm chung cho hai tỉnh Đắk Lắk và Bình Định là 11%.
18
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu
- Xác định tình hình nhiễm Leptospira trên chó tại An Giang.
- Xác định tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó theo địa bàn, giống, nhóm tuổi, giới tính, phương thức nuôi.
3.2 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1 Thời gian và địa điểm 3.2.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ tháng 7 đến tháng 10 năm 2014 Địa điểm:
- Thu thập mẫu huyết thanh ở các hộ dân trên địa bàn của tỉnh An Giang bao gồm các huyện Tịnh Biên, Chợ Mới và thành phố Long Xuyên. - Xét nghiệm được thực hiện tại Bệnh xá thú y, phòng thí nghiệm vi
trùng của Bộ môn Thú Y Trường Đại Học Cần Thơ.
3.2.2 Đối tượng nghiên cứu
Chó mọi lứa tuổi, không phân biệt giới tính. Mẫu được ghi nhận thông tin về giống, tuổi, phương thức nuôi, tình hình tiêm phòng.
Số lượng mẫu: 152 mẫu, trong đó huyện Tịnh Biên có 52 mẫu, Long Xuyên 51 mẫu, Chợ Mới 49 mẫu.
3.2.3 Thiết bị, dụng cụ
Thiết bị: Máy ly tâm, tủ lạnh, tủ ấm, kính hiển vi tụ quang nền đen.
Dụng cụ: ống tiêm, ống eppendorf, micropipette, đầu cone, ống nghiệm, đĩa nhựa 96 giếng, pipet,…
Hoá chất: dung dịch muối đệm phosphat pha loãng theo tỷ lệ 1:10 từ dung dịch đậm đặc 10 lần. - Dung dịch đậm đặc 10 lần (theo TCVN 8400-15:2011) Na2HPO4 khan 12,36 g NaH2PO4.H2O 1,80 g NaCl 85,00 g Nước vừa đủ 1000 ml
19
Kháng nguyên chuẩn: kháng nguyên sống gồm 24 chủng Leptospira do viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh cung cấp.
Bảng 3.1: Các chủng Leptospira dùng trong thực hiện phản ứng MAT Stt Serogroup Serovar Chủng
1 Australis australis Ballico
2 Autumnalis autumnalis Akiyami A
3 Bataviae bataviae Van Tienen
4 Canicola canicola Hond Utrecht IV
5 Ballum castellonis Castellon 3
6 Icterohaemorrhagiae copenhageni Wijnberg
7 Pyrogenes pyrogenes Salinem
8 Icterohaemorrhagiae tonkini LT 96 68
9 Icterohaemorrhagiae icterohaemorrhagiae Verdun
10 Cynopterie cynopterie 3522 C
11 Gryppotyphosa gryppotyphosa Moskva V
12 Sejroe hardjo Hardjo Bovis
13 Hebdomadis hebdomadis Hebdomadis
14 Javanica javanica Veldrat Bataviae 46
15 Panama panama CZ 214K
16 Semaranga patoc Patoc 1
17 Pomona pomona Pomona
18 Tarassovi tarassovi Mitis Johnson
19 Tarassovi vughia LT 09 68
20 Sejroe hardjo Hardjoprajitno
21 Sejroe saxkoebing Mus 24
22 Canicola canicola Chiffon
23 Louisiana louisiana LSU 1945
24 Husbridge husbridge Husbridge
20
3.3 Phương pháp tiến hành
Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học bệnh do Leptospira bằng phản ứng vi ngưng kết (MAT) được thể hiện qua sơ đồ sau:
Chó Kháng nguyên
Lấy mẫu máu
Chiết lấy huyết thanh
Pha loãng huyết thanh Pha loãng kháng nguyên
Phản ứng MAT
Kết quả phản ứng MAT ở 1/100
Âm tính Dương tính
Mức ngưng kết 1+ Mức ngưng kết >=2+
Nâng cao hiệu giá
Thực hiện phản ứng MAT
21
3.3.1 Phương pháp lấy mẫu.
- Máu được lấy từ tĩnh mạch chân trước đã được sát trùng bằng cồn, lấy khoảng 2-3ml.
- Cho máu vào ống không chứa chất kháng đông. Mẫu máu sau khi lấy được trữ trong thùng đá đem về ly tâm.
- Trích huyết thanh cho vào ống eppendorf đươc bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2- 8oC nếu kiểm tra trong vài ngày, nếu trữ mẫu lâu phải bảo quản tủ đông -20oC.
3.3.2 Phương pháp thực hiện phản ứng vi ngưng kết MAT Bước 1 Chuẩn bị trước khi tiến hành phản ứng Bước 1 Chuẩn bị trước khi tiến hành phản ứng
Chuẩn bị phiến kính
Mỗi mẫu huyết thanh cần dùng 3 phiến kính, mỗi phiến kính chia làm 8 ô, mỗi ô dùng cho một chủng kháng nguyên, những phiến kính này phải thật sạch, không mốc, không bị xước, trước khi dùng phải dùng bông tẩm cồn lau sạch sau đó để khô.
Kiểm tra kháng nguyên
Kiểm tra kháng nguyên bằng mắt thường: soi từng ống nghiệm chứa kháng nguyên lên trước nguồn sáng, nếu thấy kháng nguyên trong, không có kết tủa, khi lắc nhẹ nó vẩn đục như làn khói là những chủng mọc tốt.
Kiểm tra huyết thanh bằng kính hiển vi: lắc đều từng ống kháng nguyên, pha loãng kháng nguyên với dung dịch đệm bằng cách cho thêm vào từng ống kháng nguyên 2ml dung dịch đệm, lắc đều, sau đó nhỏ lần lượt từng chủng kháng nguyên lên phiến kính xem qua kính hiển vi tụ quang nền đen, kháng nguyên đạt yêu cầu phải mọc tốt, phân tán đều trong môi trường (Theo hướng dẫn của viện Pasteur Tp.Hồ Chí Minh).
Chuẩn bị huyết thanh
Huyết thanh nếu dự trữ lạnh thì rã đông trong 30 phút, đưa lên máy lắc ống trộn đều, sau đó bắt đầu pha loãng với hiệu giá pha loãng khởi đầu là 1: 50 (100µl huyết thanh với 4900 µl dung dịch đệm).
22 100 µl huyết thanh
4900 µl dung dịch đệm
Huyết thanh Huyết thanh đã pha loãng 1: 50 Hình 3.2 Sơ đồ pha loãng huyết thanh Hình 5 Bước 2 Tiến hành phản ứng vi ngưng kết
Trên mỗi ô của đĩa nhựa ta dùng pipet hút 50µl huyết thanh đã pha loãng ở nồng độ 1:50, nhỏ lần lượt vào mỗi ô, sau đó dùng pipet hút 50µl kháng nguyên vào 24 ô huyết thanh, mỗi ô một chủng tương ứng 24 chủng kháng nguyên. Dùng mỗi đầu pipet cho một mẫu huyết thanh và mỗi chủng kháng nguyên. Sau đó lắc nhẹ, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 1 giờ hoặc ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ.
Hút một giọt ở mỗi ô nhỏ lên phiến kính. Đọc kết quả dưới kính hiển vi nền đen có độ phóng đại 10 lần. Lần lượt quan sát kết quả ở 24 ô tương ứng với 24 chủng kháng nguyên.
Bước 3 Tiến hành đối chứng âm
Trên mỗi ô của đĩa nhựa nhỏ 50µl dung dịch đệm và 50µl kháng nguyên sống tương ứng với 1 chủng Leptospira. Dưới kính hiển vi nền đen Leptospira xuất hiện trên vi trường, không tự ngưng kết và chuyển động tốt.
23
Bước 4 Đánh giá kết quả
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC380950/?pageindex=5#page)
Hình 3.3Các mức độ ngưng kết trong phản ứng vi ngưng kết (MAT)Hìn
Dưới kính hiển vi nền đen với độ phóng đại 10 lần, mức độ ngưng kết được ghi nhận như sau:
- Âm tính (-): xoắn khuẩn không ngưng kết, di động tự do như đối chứng âm. - Dương tính (+): trên vi trường xuất hiện những cụm hay mảng ngưng kết trắng đục, rìa có tua do xoắn khuẩn Leptospira dính vào, số Leptospira tự do ít so với đối chứng âm. Dựa vào mức độ ngưng kết để đánh giá kết quả dương tính.
+ + + +: Tất cả Leptospira ngưng kết, cụm ngưng kết lớn, không có xoắn khuẩn tự do.
+ + +: Trên 75% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, ít xoắn khuẩn tự do. + +: Từ 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, có 1/2 số xoắn khuẩn tự do.
+: Từ 25% đến dưới 50% số xoắn khuẩn bị ngưng kết, nhiều xoắn khuẩn tự do Theo Carter (1984), quy định mức ngưng kết 50% (++) ở hiệu giá lớn hơn hoặc bằng 1:200 là dương tính, 1: 100 là nghi ngờ. Đối với những thú đã được tiêm phòng thì mức hiệu giá ngưng kết 1:1000 mới được gọi là dương tính.
24
Bước 5 Nâng cao hiệu giá
Đối với mẫu huyết thanh xét nghiệm ở mức 2+, 3+, 4+ thì tiếp tục nâng hiệu giá pha loãng huyết thanh lên 1:100, 1:200, 1:400,..cho đến khi phản ứng ngưng kết âm tính hoặc dương tính nhưng mức độ ngưng kết ở dưới mức 2+ thì mẫu huyết thanh hoàn tất.
Cách pha loãng huyết thanh: lấy 1ml huyết thanh ở nồng độ 1: 50 pha với 1ml dung dịch đệm, ta có độ pha loãng 1:100. Tương tự như vậy, pha loãng huyết thanh đến mức cần thiết. 1ml dung dịch đệm 1ml Huyết thanh 1: 100 1: 200 1: 400 … 1: 1600 đã pha loãng 1: 50
Hình 3.4 Sơ đồ nâng cao hiệu giá huyết thanh Hình 6
3.3.3 Phương pháp thống kê số liệu
Số mẫu dương tính
Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100 Tổng số mẫu khảo sát
Số liệu được xử lý thống kê theo phương pháp Chi Bình Phương (Chi - Square Test), sử dụng phần mềm Minitab 13.0 và phần mềm Excel 2013.
25
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó tại An Giang Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó tại An Giang 4 Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó tại An Giang 4
Địa bàn Số mẫu xét
nghiệm Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) P
Tịnh Biên 52 11 21,15
0,981
Long Xuyên 51 10 19,61
Chợ Mới 49 10 20,41
Tổng cộng 152 31 20,39
Hình 7Hình 4.1 Biểu đồ Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó theo địa bàn Qua bảng 4.1 cho ta thấy trong 152 mẫu khảo sát thì có 31 mẫu huyết thanh chó dương tính với Leptospira, chiếm tỷ lệ 20,39%. Kết quả trên thấp hơn nghiên cứu của Nguyễn Thị Bé Mười (2008), tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó tại thành phố Cần Thơ là 21,33%. Tuy nhiên không có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm Leptospira giữa 2 địa phương trên có thể là do An Giang và Cần Thơ là 2 tỉnh giáp nhau có mối tương đồng về khí hậu, chăm sóc nuôi dưỡng vật nuôi. Theo nghiên cứu của Lê Huỳnh Thanh Phương (2001), tỷ lệ nhiễm Leptospira
trên chó tại một số địa phương miền Bắc Việt Nam là 25,27%. Theo chúng tôi có sự khác nhau này là do sự khác biệt điều kiện địa lí, tập quán sinh sống, thời gian nghiên cứu.
26
Khi so sánh theo địa bàn cho thấy tỷ lệ nhiễmLeptospira trên chóở Tịnh Biên cao nhất là 21,15%, chó ở Long Xuyên có tỷ lệ nhiễm thấp nhất là 19,61%. Tuy nhiên sự khác biệt giữa các địa bàn không có ý nghĩa thống kê (P=0,981). Tỷ lệ nhiễm trên chó ở Tịnh Biên cao hơn so với các địa phương khác có thể được giải thích do Tịnh Biên là một huyện vùng biên giới, có địa hình vừa đồi núi vừa đồng bằng. Hằng năm lượng nước từ thượng nguồn sông MeKong đổ về rất nhanh gây ngập lụt tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loại mầm bệnh phát triển trong đó có xoắn khuẩn Leptospira. Bên cạnh đó trâu bò từ Campuchia vào cửa khẩu biên giới Tịnh Biên làm tăng khả năng lây bệnh giữa các loài. Vì vậy Tịnh Biên là địa bàn có tỷ lệ nhiễm cao nhất trong các địa bàn khảo sát.
Long Xuyên là thành phố lớn của tỉnh An Giang, có điều kiện kinh tế xã hội phát triển, phần lớn chó được nuôi nhốt nên ít có cơ hội tiếp xúc mầm bệnh. Chợ Mới là một huyện cù lao, nằm giữa sông Tiền và sông Hậu, có số dân nhiều nhất tỉnh An Giang. Chó chủ yếu được nuôi thả, vì vậy tỷ lệ nhiễm
Leptospira ở đây tương đối cao.
Kết quả trên phù hợp nghiên cứu Lê Huỳnh Thanh Phương (2001). Tỷ lệ nhiễm Leptospira ở vùng đồng trũng chiếm tỷ lệ cao nhất (28,94%), thành phố và vùng phụ cận chiếm tỷ lệ thấp nhất (18,89%).
4.2 Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó theo giống
Bảng 4.2: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó theo giống5
Giống chó Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương tính Tỷ lệ(%) P Chó ta 91 19 20,88 0,856 Chó lai 61 12 19,67
Kết quả bảng 4.2 cho thấy tỷ lệ nhiễm Leptospira trên giống chó ta là 20,88% cao hơn tỷ lệ nhiễm giống chó lai là 19,67% và sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P=0,856). Vì trong cùng môi trường sống, cùng phương thức nuôi, khả năng tiếp xúc với chuột và các chất chứa mầm bệnh là như nhau nên sự cảm nhiễm không có sự khác biệt giữa hai nhóm chó ta và chó lai.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Nhã (2010) ở xung quanh trại chăn nuôi, tỷ lệ nhiễm Leptospira ở giống chó ta là 38,89%, giống chó lai là 50%. Tỷ lệ nhiễm trên hai nhóm chó ta và chó lai đều cao hơn kết quả chúng tôi nghiên
27
cứu. Chó ở quanh trại chăn nuôi có tỷ lệ nhiễm cao hơn do có nhiều cơ hội tiếp xúc với mầm bệnh hơn, tuy nhiên sự khác biệt về giống không có ý nghĩa thống kê. Miller et al. (2007) nhận định yếu tố giống không ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm Leptospira.
4.3 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo lứa tuổi
Bảng 4.3 : Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó theo lứa tuổi Bảng 6
Lứa tuổi Số mẫu xét
nghiệm Số mẫu nhiễm Tỷ lệ(%) P
<1 năm 39 8 20,51
0,975
1-3 năm 85 18 21,18
>3-6 năm 21 4 19,05
>6 năm 7 1 14,29
Hình 4.2 Biểu đồ tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó theo lứa tuổiHình 8 Qua kết quả trình bày ở bảng 4.3 cho thấy, tất cả các nhóm tuổi ở chó đều nhiễm Leptospira, nhóm chó 1-3 năm tuổi có tỷ lệ nhiễm cao hơn các nhóm chó khác (21,18%), nhóm chó >6 năm tuổi thấp hơn các nhóm còn lại (14,29%). Tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (P=0,975).
Kết quả trên cũng phù hợp nghiên cứu của Nguyễn Thị Bé Mười (2008), chó nhiễm Leptospira ở tất cả các nhóm tuổi, cao nhất ở nhóm 1-3 năm tuổi (25%), thấp nhất ở nhóm >6 năm tuổi.
28
So sánh kết quả với Nguyễn Văn Nhã (2010) thì nghiên cứu của chúng tôi có khác, nhóm chó <1 tuổi có tỷ lệ nhiễm Leptospira cao nhất và nhóm >3-6 thấp nhất.
4.4 Tỷ lệ nhiễm Leptospira theo giới tính
Bảng 4.4: Tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó theo giới tínhBảng 7
Giới tính Số mẫu xét
nghiệm Số mẫu nhiễm Tỷ lệ(%)
P
Đực 77 14 18,18
0,630
Cái 75 17 22,67
Theo bảng 4.4 cho ta thấy tỷ lệ nhiễm Leptospira trên chó cái cao hơn trên chó đực, chiếm tỷ lệ lần lượt là 22,67% và 18,18%. Tuy nhiên sự khác nhau này không có ý nghĩa thống kê (P=0,630). Điều này cho thấy tỷ lệ nhiễm
Leptospira trên chó là không phân biệt về giới tính. Do mẫu được thu thập cùng thời gian và ở những địa bàn lân cận nhau nên môi trường sống tiếp xúc với các nhân tố lây truyền như chuột và nước tiểu của chuột, chất thải của các loài gia súc khác có chứa mầm bệnh là không khác nhau nhiều. Kết quả này có sự sai khác với nhận định của Hunter (2001) là bệnh phổ biến trên chó đực