b. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến pH, độ chua và mật độ B.bifidum
3.1.2. Khảo sát đường cong sinh trưởng của B bifidum
Quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật ở điều kiện nuôi cấy tĩnh gồm 4 pha là pha lag, pha log, pha cân bằng, pha suy vong. Trong lên men, tùy thuộc mục đích sử dụng mà người ta sẽ dừng nuôi cấy vi sinh vật ở thời điểm nhất định [4]. Do vậy việc khảo sát đường cong sinh trưởng của chúng là rất cần thiết.
Tiến hành theo dõi sự sinh trưởng của B. bifidum trên môi trường MRS dịch thể ủ 37oC. Mật độ B. bifidum được theo dõi sau mỗi 2 giờ nuôi cấy bằng cách đo OD600, từ giá trị OD đo được suy ra mật độ dựa vào đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ đã được dựng sẵn. Kết quả sinh trưởng được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2.Sự thay đổi mật độ của B. bifidum trên môi trường MRS dịch thể theo thời gian Thời gian (giờ) Mật độ Thời gian (giờ) Mật độ
Log (CFU/ml) CFU/ml Log(CFU/ml) CFU/ml
0 7,99 9,77x107 18 9,45 2,82x109 2 8,04 1,10x108 20 9,41 2,57x109 4 8,55 3,55x108 22 9,39 2,45x109 6 8,83 6,76x108 24 9,40 2,51x109 8 9,05 1,12x109 26 9,39 2,45x109 10 9,11 1,29x109 28 9,28 1,91x109 12 9,17 1,48x109 30 9,21 1,62x109 14 9,27 1,86x109 32 9,13 1,35x109 16 9,38 2,40x109
Dựa trên đường cong sinh trưởng của B. bifidum có thể thấy rằng pha lag kéo dài trong khoảng 2 giờ đầu tiên. Trong giai đoạn này, vi khuẩn thích nghi với môi trường, mật độ đạt 7,99 log (9,77x107 CFU/ml). Pha log kéo dài khoảng 16 giờ (từ 2 giờ đến 18 giờ). Tế bào sinh trưởng, phát triển mạnh và đạt cực đại ở thời điểm
44 18 giờ với mật độ 9,45 log (2,82x10 CFU/ml). Pha cân bằng kéo dài từ thời điểm 18 giờ đến 26 giờ. Ở giai đoạn này, tế bào ở trạng thái cân bằng động nên mật độ tế bào có tăng giảm nhưng luôn ổn định. Ở thời điểm 28 giờ mật độ tế bào có hiện tượng giảm mạnh từ 9,39 log xuống 9,28 log. Chứng tỏ ở thời điểm này vi khuẩn bắt đầu đi vào pha suy vong. Một phần do nguồn dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt và một phần do quá trình lên men đường tạo acid làm giảm pH trong môi trường nên ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
7.8 8.1 8.4 8.7 9 9.3 9.6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Thời gian (giờ)
Lg ( C FU /m l)
Đồ thị 3.1.Đường cong sinh trưởng của B. bifidum trên môi trường MRS
Vậy, với mục đích thu sinh khối B. bifidum bổ sung trong quá trình lên men sữa chua probiotic, ta chọn thời điểm dừng nhân giống thu sinh khối ở 18 giờ với mật độ tế bào đạt 2,82x109
(CFU/ml).
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến pH, độ chua và mật độ
B. bifidum trong quá tr nh lên men sữa chua probiotic
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ chua và mật độ của B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua probiotic
Trong các sản phẩm lên men từ sữa, giống khởi động không chỉ ức chế các vi sinh vật gây hại mà còn ức chế cả vi khuẩn probiotic. Chúng sản xuất ra bacteriocin, acid lactic, các acid hữu cơ khác và hydrogen peroxide để ức chế các vi sinh vật khác. Thêm vào đó, giống khởi động tăng trưởng nhanh hơn vi khuẩn
45 probiotic, cạnh tranh mạnh mẽ về nguồn dinh dưỡng. Vì vậy vi khuẩn probiotic chưa kịp tăng trưởng đã bị ức chế [23]. Trong sữa chua, sự tương tác sinh học giữa các chủng vi khuẩn trong cùng môi trường là rất phức tạp. Ngoài quá trình cộng sinh giữa Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus thermophilus, còn có quá trình tác động của giống khởi động lên vi khuẩn probiotic. Mặt khác, giống khởi động lại đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp hương vị đặc trưng của sữa chua truyền thống [23]. Tuy nhiên, giống khởi động lại yếu hoạt tính probiotic và nhạy cảm với các stress của điều kiện kỹ thuật như nhiệt độ cao, áp suất cao. Do đó vi khuẩn probiotic phải được lên men chung với giống khởi động. Chủng vi khuẩn probiotic sử dụng trong đề tài là một chủng đã được chứng minh có hoạt tính probiotic cao [21] và có khả năng chịu nhiệt. Có nhiều phương pháp để hạn chế sự ức chế của chúng lên vi khuẩn probiotic. Theo nghiên cứu của Shah và cộng sự (1997), lên men hai bước là một kỹ thuật đơn giản nhưng hiệu quả. Đây là kỹ thuật lên men 2 giai đoạn, giai đoạn đầu bổ sung vi khuẩn probiotic, sau 2 giờ bổ sung thêm giống khởi động và tiếp tục quá trình lên men. Ở thí nghiệm này chúng tôi cố định tổng thời gian lên men là 9 giờ.
Thời điểm kết thúc lên men thường được xác định bởi giá trị pH [27]. Bên cạnh đó theo TCVN 7030:2002 thì độ chua của sữa chua phải đạt từ 75 – 140 (oTh). Hơn nữa mục tiêu đề tài là tạo sữa chua probiotic nên chỉ tiêu quan trọng nhất là mật độ B. bifidum. Vì vậy, trong thí nghiệm này cả 3 chỉ tiêu trên đều được theo dõi để đánh giá.
46
Đồ thị 3.2. Sự thay đổi pH dưới ảnh hưởng của thứ tự cấy giống
Từ đồ thị 3.2 cho thấy thời gian lên men càng dài thì pH càng giảm. Tại thời điểm kết thúc quá trình lên men, pH ở nghiệm thức bổ sung B. bifidum trước (2-1) đạt 4,8, còn ở nghiệm thức bổ sung giống khởi động trước (2-2) là 5,11. Ở nghiệm thức 2-1 ta thấy pH giảm chậm trong 2 giờ đầu tiên vì đây là khoảng thời gian B. bifidum thích nghi với môi trường và ở 5 giờ tiếp theo (từ 2 - 7 giờ) pH giảm nhanh hơn do thời gian này B. bifidum đang tăng trưởng đồng thời giống khởi động được bổ sung vào nên acid lactic tích lũy trong môi trường nhiều. Còn ở nghiệm thức 2-2 thì ngược lại khoảng 4 giờ đầu tiên pH giảm nhanh do giống khởi động thích nghi, tăng trưởng và tạo sản phẩm trao đổi chất mà chủ yếu là acid lactic và 3 giờ tiếp theo thì pH giảm chậm lại vì đây là thời điểm bổ sung thêm B. bifidum nên có sự cạnh tranh mạnh mẽ về dinh dưỡng và ức chế giữa các chủng vi khuẩn. Từ thời điểm 7 – 9 giờ, khi pH đạt gần bằng 5 không còn sự khác biệt đáng kể giữa 2 nghiệm thức. Vì theo những nghiên cứu trước đây thì B. bifidum sống được trong môi trường có pH lớn hơn 5. Với giá trị pH nhỏ hơn 5 vi sinh vật này bị ức chế. Khi pH giảm xuống 4,6 và thấp hơn thì B. bifỉum bị ức chế mạnh mẽ [21]. Do đó, dựa theo giá trị pH để kết thúc quá trình lên men cả 2 nghiệm thức trên đều thích hợp. 4.5 5 5.5 6 6.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Thời gian (giờ)
pH
(2-1) (2-2)
47
Đồ thị 3.3. Sự thay đổi độ chua dưới ảnh hưởng của thứ tự
Dựa vào đồ thị 3.3 cho thấy thời gian lên men càng dài thì độ chua càng tăng. Tuy nhiên, ở cả 2 nghiệm thức độ chua tăng chậm trong 2 giờ đầu tiên và tăng nhanh hơn trong 7 giờ tiếp theo. Độ chua là đại lượng thể hiện lượng acid sinh ra trong suốt quá trình lên men, môi trường càng có nhiều acid thì độ chua càng cao. Theo lập luận như trên, lượng acid sinh ra ban đầu trong môi trường lên men rất ít vì đây là giai đoạn chủ yếu để vi khuẩn thích nghi với môi trường, sau đó acid tích lũy trong môi trường tăng theo thời gian lên men nên độ chua cũng tăng dần. Kết thúc quá trình lên men độ chua ở nghiệm thức 2-1 là 88 (oTh) và nghiệm thức 2-2 là 69 (oTh). Như vậy chỉ có nghiệm thức 2-1 là có độ chua nằm trong khoảng quy định theo TCVN 7030-2002 (phụ lục 4, bảng 4). Nên dựa vào giá trị độ chua, chúng tôi chọn nghiệm thức 2-1 để kết thúc quá trình lên men.
Tuy nhiên, chỉ tiêu quan trọng nhất để chúng tôi quyết định lựa chọn 1 trong 2 nghiệm thức trên là mật độ B. bifidum, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3.Mật độ tế bào B. bifidum dưới sự ảnh hưởng của thứ tự cấy giống
Nghiệm thức Mật độ tế bào B. bifidum
Log (CFU/ml) CFU/ml
2-1 8,85 7,08x108 2-2 8,23 1,70x108 10 30 50 70 90 110 130 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Thời gian (giờ)
Đ ộ chu a (oT h) (2-1) (2-2)
48 Từ bảng 3.3 cho thấy kết thúc quá trình lên men ở nghiệm thức 2-1 mật độ B. bifidum là 7,08x108 CFU/ml, còn nghiệm thức 2-2 có mật độ B. bifidum đạt 1,70x108 CFU/ml. Qua số liệu trên cho thấy mật độ B. bifidum ở nghiệm thức 2-1 gấp 4,16 lần ở nghiệm thức 2-2. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Shah và cộng sự (1997) khi áp dụng lên men 2 bước, mật độ vi khuẩn probiotic tăng từ 4 – 5 lần. Ban đầu vi khuẩn probiotic sẽ được lên men trong 2 giờ, sau đó mới bổ sung giống khởi động vào quá trình lên men. Trong khoảng thời gian 2 giờ vi khuẩn probiotic sẽ tiến tới cuối pha lag và sớm đi vào pha log, vì vậy chúng sẽ chiếm ưu thế hơn, kết quả là mật độ cao hơn [23].
Dựa trên những lập luận và kết quả của 2 nghiệm thức được khảo sát, chúng tôi quyết định chọn nghiệm thức 2-1 là bổ sung B. bifidum trước 2 giờ rồi mới bổ sung giống khởi động trong quá trình lên men cho những thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến pH, độ chua và mật độ của B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
Bản thân quá trình lên men sữa chua cũng có thể được xem là quá trình đáp ứng với acid [17]. Bởi vậy trong suốt quá trình lên men vi khuẩn probiotic phải chịu đựng với nhiều loại stress khác nhau từ việc giảm pH do acid tích lũy nhiều trong môi trường, hydrogen peroxide gây độc do giống khởi động sinh ra đến việc cạnh tranh về dinh dưỡng. Do đó việc thăm dò một số chất có khả năng bảo vệ tính sống cho vi khuẩn probiotic để đảm bảo chức năng của sữa chua probiotic là rất cần thiết. Nhân tố bifido (prebiotic) là một trong hai nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự tăng trưởng của vi khuẩn probiotic. Vì vậy sử dụng sữa chua synbiotic là sự kết giữa sữa chua probiotic và bổ sung thêm prebiotic được chứng minh là hiệu quả hơn khi sử dụng riêng lẻ. Vì khi kết hợp với nhau prebiotic kích thích probiotic tăng trưởng mạnh mẽ. WPC là một trong những prebiotic được nghiên cứu là cho hiệu quả tốt nhất nhờ hàm lượng whey protein trong nó [5].
Chúng tôi lựa chọn ba nồng độ 0%, 0,5% và 1% hàm lượng WPC để khảo sát ảnh hưởng của chúng đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên
49 men sữa chua probiotic. Kết quả được trình bày trong đồ thị 3.3, đồ thị 3.4 và bảng 3.4.
Đồ thị 3.4.Sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC đến pH trong sữa chua synbiotic theo thời gian lên men
Dựa vào đồ thị 3.4, trong suốt quá trình lên men sự thay đổi pH trải qua 3 giai đoạn. Giai đoạn đầu pH giảm chậm trong 2 giờ, pH giảm nhanh trong 5 giờ tiếp theo và 2 giờ cuối cùng là tốc độ acid hóa chậm dần. Sự chênh lệch pH giữa các nghiệm thức là không đáng kể, tương ứng hàm lượng WPC bổ sung lần lượt là 0%, 0,5% và 1% thì pH là 4,8, 4,79 và 4,77. Khi tăng dần hàm lượng WPC bổ sung vào nguyên liệu lên men thì pH tương ứng vào cuối thời điểm lên men giảm dần. Do WPC làm tăng hàm lượng chất khô trong nguyên liệu dẫn đến việc kích thích sự tăng trưởng của vi khuẩn probiotic, làm giảm pH nhanh hơn.
4.5 5 5.5 6 6.5 7 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Thời gian (giờ)
pH
0% WPC (2A) 0.5% WPC (2B) 1% WPC (2C)
50
Đồ thị 3.5.Sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC đến độ chua trong sữa chua synbiotic theo thời gian lên men
Từ đồ thị 3.4 cho thấy độ chua tăng dần trong suốt quá trình lên men. Do suốt quá trình lên men lượng acid do vi khuẩn sinh ra tích lũy trong môi trường nhiều nên làm độ chua tăng. Kết thúc quá trình lên men độ chua ở các nghiệm thức 2A, 2B, 2C lần lượt là 88, 90, 92 (oTh). Sự chênh lệch giá trị độ chua giữa các nghiệm thức là 2 đơn vị và kết quả cả 3 nghiệm thức đều nằm trong khoảng quy định về độ chua của sữa chua (phụ lục 4, bảng 4).
Bảng 3.4. Mật độ tế bào B. bifidum dưới sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC
Nghiệm thức Mật độ tế bào B. bifidum
Log (CFU/ml) CFU/ml
2A (Đối chứng) 8,85 7,08x108
2B 9,21 1,62x109
2C 10,51 3,23x1010
Bảng 3.4 cho biết mật độ B. bifidum ở các hàm lượng WPC khác nhau. So với nghiệm thức đối chứng (2A) thì mật độ B. bifidum ở 2 nghiệm thức còn lại đều tăng. Nghiệm thức 2B, 2C có mật độ B. bifidum tăng lần lượt là 2,29 lần và 4,56 lần so với nghiệm thức 2A. Việc bổ sung WPC làm tăng cường khả năng sống của
10 30 50 70 90 110 130 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Thời gian lên (giờ)
Đ ộ c h u a (o T h ) 0% WPC ( 2A) 0.5% WPC (2B) 1% WPC (2C)
51 vi khuẩn probiotic. WPC chứa một lượng lớn peptide và amino acid sẵn có đáp ứng kịp thời nhu cầu tăng trưởng của vi khuẩn probiotic ([5], [9]). Trong nghiên cứu của A. S. Akalin và cộng sự (2007), Adriane E C Antunes (2005) cũng ghi nhận điều tương tự trong sữa chua có bổ sung WPC.
Kết hợp các phân tích về chỉ tiêu pH, độ chua, mật độ B. bifidum trong sữa chua synbiotic của thí nghiệm này cho thấy nghiệm thức 2C bổ sung 1% WPC có mật độ B. bifidum cao nhất là 3,23x1010 CFU/ml, đồng thời pH và độ chua ở thời điểm kết thúc quá trình lên men đều chấp nhận được nên chúng tôi chọn để thực hiện tiếp các thí nghiệm sau.
3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của WPC đến sữa chua synbiotic theo thời gian
bảo quản
Để đảm bảo lợi ích sức khỏe, sữa chua probiotic khi được sử dụng phải có mật độ vi khuẩn probiotic lớn hơn 107 CFU/ml [15]. Mặt khác trong quá trình bảo quản sản phẩm ở 4 – 6oC các vi sinh vật vẫn hoạt động nhưng ở tốc độ chậm nên các chỉ tiêu lý, hóa của sản phẩm vẫn tiếp tục thay đổi. Do đó để đảm bảo chất lượng sữa chua probiotic chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát thời gian bảo quản trong 28 ngày và kết quả được thể hiện trong bảng 3.5.
52
Bảng 3.5.Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến chất lượng sữa chua synbiotic
Mật độ B. bifidum ban
đầu 7,45 (log CFU/ml) Thời gian bảo quản ở 4
o C (ngày) Đối chứng 0 1 3 7 14 21 28 Mật độ B. bifidum (log CFU/ml) 8,85 8,60 8,23 7,42 7,16 6,13 5,08 pH 4,79 4,78 4,77 4,68 4,66 4,50 4,36 Độ chua 90 90 92 102 104 118 134 1% WPC 0 1 3 7 14 21 28 Mật độ B. bifidum (log CFU/ml) 10,51 10,30 10,07 9,82 9,13 8,41 7,52 pH 4,74 4,74 4,70 4,68 4,59 4,43 4,28 Độ chua 95 95 100 102 110 126 145
Đồ thị 3.5. Sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC đến pH trong sữa chua synbiotic theo thời gian bảo quản
3.8 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 0 4 8 12 16 20 24 28 Đối chứng 1% WPC pH
53
Đồ thị 3.6.Sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC đến độ chua trong sữa chua synbiotic theo thời gian bảo quản
Đồ thị 3.7. Sự ảnh hưởng của hàm lượng WPC đến mật độ B. bifidum trong sữa chua synbiotic theo thời gian bảo quản
Dựa vào đồ thị 3.5, 3.6 cho thấy, sau 28 ngày bảo quản ở mẫu đối chứng pH giảm 0,43 đơn vị, còn mẫu 1% WPC pH giảm 0,46 đơn vị và pH giảm có lúc nhanh lúc chậm trong thời gian bảo quản. Đi kèm với việc pH giảm thì độ chua tăng 44oTh đối với mẫu đối chứng và 50oTh đối với mẫu 1% WPC. Qua đó cho
80 90 100 110 120 130 140 150 0 4 8 12 16 20 24 28 Đối chứng 1% WPC Độ chua
Thời gian (ngày)
4 5 6 7 8 9 10 11 0 4 8 12 16 20 24 28 đối chứng 1% WPC Mật độ B. bifidum
54 thấy mặc dù mẫu bảo quản ở nhiệt độ lạnh nhưng vẫn có sự thay đổi về đặc điểm