Bản thân quá trình lên men sữa chua cũng có thể được xem là quá trình đáp ứng với acid [17]. Bên cạnh đó, canh trường vi sinh vật ở pha cân bằng có khả năng chịu đựng cao với nhiều loại stress khác nhau hơn ở pha tăng trưởng, bởi vì tại pha cân bằng đã khan hiếm nguồn cacbon và nguồn thức ăn sẵn có giảm dần gây ra sự thích ứng stress trước khi sấy phun [18].
1.6.3 Bổ sung cơ chất hỗ trợ
Gần đây, những nhà nghiên cứu đã tập trung vào những thành phần tự nhiên như fructooligosaccharide (FOS) và whey protein concentrate (WPC) là những chất thay thế béo và kích thích tăng trưởng vi khuẩn probiotic. Việc bổ sung FOS và WPC được chứng minh là tăng cường khả năng sống của vi khuẩn probiotic [9]. FOS được tìm thấy là prebiotic có hiệu quả nhất trong việc duy trì khả năng sống của probiotic trong sữa chua. Tuy nhiên, khi sữa chua được sấy thăng hoa, thì việc bổ sung này dường như làm giảm khả năng sống của probiotic [20].
Prebiotic được sử dụng phổ biến ở nhiều quốc gia là inulin và oligofructose. Oligofructose có giá trị năng lượng thấp hơn các carbonhydrate khác vì liên kết điển hình là β (12). Liên kết này không bị phân hủy bởi enzyme trong đường ruột của con người [22]. Theo cách đó, chúng có thể đi qua miệng, bao tử và ruột non mà không bị phân hủy. Chúng ngăn cản sự phát triển của các vi sinh vật gây hại bởi việc giảm pH do hình thành các acid béo mạch ngắn như acid acetic, propionic, pyruvic tại thời điểm cuối của quá trình lên men. Chúng cũng làm giảm lượng triglyceride và cholesterol trong máu [10].
31 Khi bổ sung oligofructose không nhận thấy có sự khác biệt đáng chú ý về thành phần hóa học so với mẫu đối chứng. Tuy nhiên, cấu trúc và giá trị acid hữu cơ tạo ra thì có khác biệt quan trọng. Điểm cảm quan của mẫu đối chứng là cao hơn so với những mẫu sữa chua khác. Tuy nhiên điểm cảm quan đối với những mẫu có bổ sung FOS là chấp nhận được [22].
Shin, Lee, Pestka và Ustunol (2000) tìm thấy rằng khả năng sống của
Bifidobacterium spp. trong sữa gầy được cải thiện 55,7% sau 4 tuần ở điều kiện bảo quản lạnh khi được bổ sung FOS.
Việc bổ sung thêm một vài cơ chất như whey protein có thể nâng cao khả năng sống của một vài probiotic [26].
Khả năng kích thích tăng trưởng của WPC có thể do hàm lượng whey protein trong nó [5]. Whey protein với khối lượng phân tử lớn sẽ được cắt nhỏ bởi enzyme và các yếu tố tăng trưởng được hình thành [5]. WPC chứa một lượng peptide và amino acid sẵn có đáp ứng kịp thời nhu cầu tăng trưởng của vi khuẩn probiotic. WPC cũng cung cấp nguồn peptide và amino acid khi hỗn hợp sữa chua bị xử lý bởi nhiệt độ. Whey protein có lượng amino acid chứa lưu huỳnh nhiều. Các amino acid này sẽ được giải phóng bởi nhiệt làm giảm xuống khả năng oxy hóa khử ([9], [23]). Thêm vào đó, WPC nâng cao khả năng sống do chính protein trong nó và hàm lượng phosphate nâng cao khả năng vận chuyển probiotic của sữa chua
WPC cải thiện cấu trúc, khả năng giữ nước, khả năng vận chuyển và thời gian lên men khi so sánh với sữa chua chỉ làm từ sữa gầy [7].
Dave và Shah (1998) và Bhullar cùng cộng sự (2002) nhận định rằng khi bổ sung WPC sẽ tăng độ ổn định, độ nhớt và mùi vị của sữa chua. Việc bổ sung WPC duy trì tỷ lệ sống sót của B. bifidum mà không ảnh hưởng đến độ chấp nhận cảm quan tổng thể của sữa chua probiotic tại 4oC trong thời gian bảo quản ít nhất 4 tuần [8].
32
2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và môi trƣờng
2.1.1 Nguyên vật liệu
Nguyên liệu
- Sữa tươi tiệt trùng có đường Vinamilk.
- Whey protein concentrate (WPC) của PureBulk, Mỹ.
Giống vi sinh vật
- Giống Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, B. bifidum do Bộ môn CNSH – Đại Học Bách Khoa TPHCM cung cấp.
2.1.2 Môi trường, hóa chất
Môi trường - Môi trường MRS dịch thể: Peptone 10g Cao thịt 10g Cao nấm men 5g Glucose 20g MgSO4.7H2O 0,205g CH3COONa.3H2O 8,293g K2HPO4.3H2O 2,62g Amoni citrate 2g MnSO4.H2O 0,056g Nước cất 1 lít pH 6,2 - Môi trường LP – MRS: Peptone 10g Cao thịt 10g Cao nấm men 5g Glucose 20g MgSO4.7H2O 0,205g Lithium chloride 2g Nước cất 1lít CH3COONa.3H2O 8,293g K2HPO4.3H2O 2,62g Amoni citrate 2g MnSO4.H2O 0,056g Agar 20g Sodium propionate 3g pH 6,2
- Môi trường MRS agar: môi trường MRS dịch thể có bổ sung 20(g/l) agar. - Môi trường MRS acid: thành phần tương tự MRS, pH 5,2.
33 - Môi trường lên men: sữa tươi tiệt trùng có đường Vinamilk.
- Dung dịch nước muối sinh lý: 9g NaCl/1lít nước cất.
Hóa chất
Thuốc nhuộm Lugol, Fuchsin, Tím tinh thể, Cồn 90o, Phenolphtalein 1%, CuSO4, K2SO4, H2SO4, HCl 0,5N, NaOH 0,1N, HCl 10%, NaOH 10%, NaCl…
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ sử dụng
Kính hiển vi quang học, máy sấy phun Mini Spray Dryer – Yamoto, máy ly tâm, máy vortex, máy đo pH, máy đo quang phổ, tủ cấy vô trùng, cân điện tử, nồi hấp tiệt trùng, bếp điện, tủ lạnh, máy đo độ ẩm,tủ ấm, máy đun từ.
Các dụng cụ thí nghiệm gồm đĩa Petri, ống nghiệm, que cấy, bình tam giác, cốc thủy tinh, đèn cồn…
2.2 Nội dung nghiên cứu
Hình 2.1. Nội dung nghiên cứu tổng quát
WPC Nguyên liệu
Kiểm tra đặc điểm sinh học của giống
Lên men Khảo sát ảnh hưởng: - Thứ tự cấy giống - Hàm lượng WPC Giống Sữa chua synbiotic Sấy phun Bột sữa chua synbiotic Theo dõi thời
gian bảo quản sữa chua synbiotic
WPC Nguyên liệu
Kiểm tra đặc điểm sinh học của giống
Lên men
Khảo sát ảnh hưởng: - Thứ tự cấy giống - Hàm lượng WPC
34
2.2.1. Kiểm tra đặc điểm sinh học của giống
Mục đích
Kiểm tra tính thuần, hình dạng và đường cong sinh trưởng của chủng giống sử dụng.
Cách tiến hành
a. Quan sát hình thái đại thể, vi thể
Giống B. bifidum ở dạng thạch nghiêng được cấy làm thuần trên các đĩa Petri, nuôi cấy trên môi trường thạch MRS ủ ở 37oC trong 72 giờ.
Sau thời gian ủ, quan sát hình thái, độ đồng nhất của các khuẩn lạc.
Chọn khuẩn lạc đặc trưng, tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào. b. Khảo sát đường cong sinh trưởng của B. bifidum
Mục đích
Xác định thời gian sinh trưởng của B. bifidum, từ đó chọn thời điểm sinh khối đạt cao nhất để kết thúc nhân giống trước khi bổ sung lên men.
Cách thực hiện:
Cấy nhân giống cấp 1 từ ống thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường MRS lỏng, ủ 37oC trong 24 giờ.
Cấy nhân giống cấp 2 từ ống nghiệm nhân giống cấp 1 sang bình chứa 100ml môi trường MRS lỏng (thể tích cấy 10%), ủ 37o
C. Sau mỗi 2 giờ nuôi cấy, lấy mẫu đo độ đục ở bước sóng 600nm.
Dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục (giá trị OD600) và số lượng vi khuẩn (CFU/ml).
Dựa vào đường tương quan tuyến tính ở trên suy ra mật độ vi khuẩn ứng với giá trị OD600 đo được tại mỗi thời điểm.
Vẽ đường cong sinh trưởng của B. bifidum.
2.2.2 Chuẩn bị giống cho quá trình lên men
Giống khởi động được nhân giống trên môi trường sữa trước khi lên men. Mật độ Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus thermophilus trong môi trường nhân
35 giống lần lượt là 6,7x10 CFU/ml và 1,8x10 CFU/ml (tỉ lệ 1 : 2,5). Tỷ lệ cấy giống khởi động là 2%.
Giống B. bifidum được nhân giống cấp 1 từ ống thạch nghiêng vào ống nghiệm MRS dịch thể đã được vô trùng, đem nuôi trong tủ ấm 37oC trong 18 giờ. Sau đó, giống được nhân giống cấp 2 vào bình MRS dịch thể đem nuôi trong tủ ấm đến 37oC đến khi sinh khối đạt tối đa. Sinh khối B. bifidum thu được bằng cách ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, rửa nước muối sinh lý 2 lần trước khi sử dụng lên men.
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng một số yếu tố đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua probiotic.
a. Khảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua probiotic bifidum trong quá trình lên men sữa chua probiotic
Mục đích
Xác định thứ tự cấy giống cho mật độ B. bifidum cao và pH, độ chua thích hợp sau khi kết thúc quá trình lên men.
Bố trí thí nghiệm
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệmkhảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
Nghiệm thức Mô tả thứ tự cấy giống
2-1
Cấy giống B. bifidum và ủ tại 37oC trong 2 giờ. Sau đó, cấy giống khởi động rồi ủ ở 43o
C trong 7 giờ.
2-2
Cấy giống khởi động và ủ tại 43oC trong 4 giờ. Sau đó cấy giống B. bifidum rồi ủ 37oC trong 5 giờ.
Chuẩn bị thí nghiệm
- Giống: L. bulgaricus, S. thermophilus, B. bifidum.
- Mỗi nghiệm thức chuẩn bị 11 mẫu (25ml môi trường lên men/mẫu). Trong đó có 1 mẫu dùng để xác định mật độ và 10 mẫu còn lại dùng để xác định pH, độ chua theo thời gian.
36
Tiến hành thí nghiệm
- Bổ sung 1% B. bifidum và 2% giống khởi động theo thứ tự và điều kiện lên men cụ thể theo từng nghiệm thức.
- Theo dõi sự thay đổi pH và độ chua trong tổng thời gian lên men là 9 giờ. - Sau 9 giờ lên men xác định mật độ B. bifidum tại từng nghiệm thức.
Chỉ tiêu đánh giá
pH, độ chua, mật độ B. bifidum tại thời điểm kết thúc lên men.
Hình 2.2. Sơ đồkhảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
43oC, 4 giờ 37oC, 2giờ Ủ Cấy giống Cấy giống 43oC, 7 giờ 37oC, 5 giờ Môi trường lên men B. bifidum Giống khởi động B. bifidum Ủ Sữa chua synbiotic Giống khởi động
37 b. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
Mục đích:
Xác định hàm lượng WPC tối ưu trong khoảng khảo sát cho kết quả mật độ B. bifidum cao và pH, độ chua thích hợp sau khi kết thúc quá trình lên men.
Bố trí thí nghiệm
Tùy thuộc vào kết quả mục a, chúng tôi xác định được thứ tự cấy giống để bố trí cho thí nghiệm này.
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệmkhảo sát ảnh hưởng của WPC đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
Nghiệm thức
(Thứ tự cấy giống được chọn ở mục a )
Hàm lƣợng WPC
2A (Đối chứng) 0%
2B 0.5%
2C 1%
Chuẩn bị thí nghiệm
- Giống: L. bulgaricus, S. thermophilus, B. bifidum.
- Mỗi nghiệm thức chuẩn bị 11 mẫu (25ml môi trường lên men/mẫu). Trong đó có 1 mẫu dùng để xác định mật độ và 10 mẫu còn lại dùng để xác định pH, độ chua theo thời gian.
Tiến hành thí nghiệm
- Bổ sung 1% B. bifidum và 2% giống khởi động theo thứ tự và điều kiện lên men được chọn ở mục a.
- Theo dõi sự thay đổi pH và độ chua trong tổng thời gian lên men là 9 giờ. - Sau 9 giờ lên men xác định mật độ B. bifidum tại từng nghiệm thức.
Chỉ tiêu đánh giá
38
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến sữa chua synbiotic theo thời gian bảo quản bảo quản
Mục đích
Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến mật độ B. bifidum, pH và độ chua theo thời gian bảo quản 4 tuần.
Bố trí thí nghiệm
Theo kết quả có được từ các thí nghiệm ở mục 2.2.3 mà xác định được thứ tự cấy giống và hàm lượng WPC bổ sung vào nguyên liệu tối ưu cho quá trình này.
Chuẩn bị thí nghiệm
- Giống: L. bulgaricus, S. thermophilus, B. bifidum
- Môi trường lên men được bổ sung WPC theo hàm lượng tối ưu được xác định tại mục 2.2.3b và môi trường lên men không bổ sung WPC làm mẫu đối chứng.
- Chuẩn bị 4 mẫu chứa 100ml môi trường lên men/mẫu, trong đó có 2 mẫu bổ sung WPC ở hàm lượng tối ưu và 2 mẫu không bổ sung WPC (mẫu đối chứng).
Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị giống theo mục 2.2.2.
- Bổ sung 1% giống B. bifidum và 2% giống khởi động.
- Theo dõi mật độ B. bifidum, pH, độ chua theo thời gian bảo quản tại 0 ngày, 1 ngày, 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày, 28 ngày cho mẫu có bổ sung hàm lượng WPC tối ưu và mẫu đối chứng.
Chỉ tiêu đánh giá
39
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến mật độ B. bifidum khi áp dụng phương pháp sấy phun tạo bột sữa chua synbiotic.
Mục đích
Khảo sát ảnh hưởng của WPC với hàm lượng bổ sung được tối ưu ở các thí nghiệm trước đến mật độ B. bifidum khi áp dụng phương pháp sấy phun tạo bột sữa chua synbiotic.
Bố trí thí nghiệm
Trong thí nghiệm này có 2 nghiệm thức có bổ sung WPC và không bổ sung WPC với các thông số tối ưu được cố định ở các thí nghiệm trước.
Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị 2 mẫu (1lít/mẫu) có bổ sung và không bổ sung WPC theo như thí nghiệm ở mục 2.2.4.
- Hai mẫu sữa chua trên được khuấy kỹ (để phá cấu trúc gel, giảm độ nhớt, tránh làm nghẹt vòi phun).
- Thực hiện sấy phun 2 mẫu bằng máy sấy phun Mini Spray Dryer – Yamoto với các thông số sau:
+ Lưu lượng dịch phun: 2cm3
/giây + Áp suất phun: 2kg/cm3
+ Nhiệt độ đầu vào: 90 – 100o
C + Nhiệt độ đầu ra: 40 – 45oC
- Hai mẫu sau khi sấy phun được xác định mật độ B. bifidum.
Chỉ tiêu đánh giá
Mật độ B. bifidum, độ ẩm và tỷ lệ sống của B. bifidum.
Tỷ lệ sống (%) được xác định theo công thức: (log(N)/log(N0 f))100 Trong đó: N là mật độ tế bào sau sấy phun (CFU/g)
N0 là mật độ tế bào trước sấy phun (CFU/ml).
40
2.3 Phƣơng pháp phân tích
2.3.1. Phương pháp vi sinh
a. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram
Dựa vào khả năng bắt khác nhau của vi khuẩn Gram âm và Gram dương quy định bởi vách tế bào. Vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu tím do có lớp peptidoglycan dày, vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng do lớp peptidoglycan ít hơn.
Thực hiện tiêu bản nhuộm Gram với cả 3 chủng giống. Quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x100. Ghi nhận sự bắt màu, hình dạng tế bào.
b. Phương pháp định lượng bằng cách đếm khuẩn lạc
Các mẫu sữa chua synbiotic và bột sữa chua synbiotic được pha loãng theo hệ thập phân bằng nước muối sinh lý trước khi cấy trải trên các môi trường. B. bifidum được định lượng trên môi trường thạch LP – MRS ở 37oC trong 72 giờ.
2.3.2. Phương pháp hóa lý
a. Xác định pH của sữa chua
pH của sữa chua được đo bằng máy đo pH Eutech instruments pH 510. b. Xác định độ chua trong sữa chua
Độ chua oT của sữa chua là số ml NaOH 0,1N cần để trung hòa 100ml sữa chua trong 200ml nước cất.[4]
Phương pháp thực hiện
Lấy 10ml sữa chua và 20ml nước cất cho vào erlen, lắc đều và cho vài giọt thuốc thử phenolphthalein. Định lượng bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi dung dịch chuyển màu hồng.
41
3.1. Kiểm tra đặc điểm sinh học của giống
3.1.1. Quan sát hình thái đại thể và vi thể
Giống khởi động có nguồn gốc từ bộ sưu tập giống của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM được cung cấp đầy đủ thông tin về hình thái và đặc điểm đại thể, vi thể.
Giống B. bifidum trước khi sử dụng lên men được cấy tạo khuẩn lạc đơn trên môi trường chọn lọc riêng biệt để kiểm tra độ đồng nhất, sau đó nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào.
Hình thái và đặc điểm cụ thể của các giống được miêu tả trong hình 3.1, hình 3.2 và bảng 3.1.
(a) (b)
(c)
Hình 3.1. Hình thái đại thể của giống khởi động và B. bifidum trên các môi