Giống khởi động được nhân giống trên môi trường sữa trước khi lên men. Mật độ Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus thermophilus trong môi trường nhân
35 giống lần lượt là 6,7x10 CFU/ml và 1,8x10 CFU/ml (tỉ lệ 1 : 2,5). Tỷ lệ cấy giống khởi động là 2%.
Giống B. bifidum được nhân giống cấp 1 từ ống thạch nghiêng vào ống nghiệm MRS dịch thể đã được vô trùng, đem nuôi trong tủ ấm 37oC trong 18 giờ. Sau đó, giống được nhân giống cấp 2 vào bình MRS dịch thể đem nuôi trong tủ ấm đến 37oC đến khi sinh khối đạt tối đa. Sinh khối B. bifidum thu được bằng cách ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, rửa nước muối sinh lý 2 lần trước khi sử dụng lên men.
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng một số yếu tố đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua probiotic.
a. Khảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua probiotic bifidum trong quá trình lên men sữa chua probiotic
Mục đích
Xác định thứ tự cấy giống cho mật độ B. bifidum cao và pH, độ chua thích hợp sau khi kết thúc quá trình lên men.
Bố trí thí nghiệm
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệmkhảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
Nghiệm thức Mô tả thứ tự cấy giống
2-1
Cấy giống B. bifidum và ủ tại 37oC trong 2 giờ. Sau đó, cấy giống khởi động rồi ủ ở 43o
C trong 7 giờ.
2-2
Cấy giống khởi động và ủ tại 43oC trong 4 giờ. Sau đó cấy giống B. bifidum rồi ủ 37oC trong 5 giờ.
Chuẩn bị thí nghiệm
- Giống: L. bulgaricus, S. thermophilus, B. bifidum.
- Mỗi nghiệm thức chuẩn bị 11 mẫu (25ml môi trường lên men/mẫu). Trong đó có 1 mẫu dùng để xác định mật độ và 10 mẫu còn lại dùng để xác định pH, độ chua theo thời gian.
36
Tiến hành thí nghiệm
- Bổ sung 1% B. bifidum và 2% giống khởi động theo thứ tự và điều kiện lên men cụ thể theo từng nghiệm thức.
- Theo dõi sự thay đổi pH và độ chua trong tổng thời gian lên men là 9 giờ. - Sau 9 giờ lên men xác định mật độ B. bifidum tại từng nghiệm thức.
Chỉ tiêu đánh giá
pH, độ chua, mật độ B. bifidum tại thời điểm kết thúc lên men.
Hình 2.2. Sơ đồkhảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
43oC, 4 giờ 37oC, 2giờ Ủ Cấy giống Cấy giống 43oC, 7 giờ 37oC, 5 giờ Môi trường lên men B. bifidum Giống khởi động B. bifidum Ủ Sữa chua synbiotic Giống khởi động
37 b. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
Mục đích:
Xác định hàm lượng WPC tối ưu trong khoảng khảo sát cho kết quả mật độ B. bifidum cao và pH, độ chua thích hợp sau khi kết thúc quá trình lên men.
Bố trí thí nghiệm
Tùy thuộc vào kết quả mục a, chúng tôi xác định được thứ tự cấy giống để bố trí cho thí nghiệm này.
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệmkhảo sát ảnh hưởng của WPC đến pH, độ chua và mật độ B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua synbiotic
Nghiệm thức
(Thứ tự cấy giống được chọn ở mục a )
Hàm lƣợng WPC
2A (Đối chứng) 0%
2B 0.5%
2C 1%
Chuẩn bị thí nghiệm
- Giống: L. bulgaricus, S. thermophilus, B. bifidum.
- Mỗi nghiệm thức chuẩn bị 11 mẫu (25ml môi trường lên men/mẫu). Trong đó có 1 mẫu dùng để xác định mật độ và 10 mẫu còn lại dùng để xác định pH, độ chua theo thời gian.
Tiến hành thí nghiệm
- Bổ sung 1% B. bifidum và 2% giống khởi động theo thứ tự và điều kiện lên men được chọn ở mục a.
- Theo dõi sự thay đổi pH và độ chua trong tổng thời gian lên men là 9 giờ. - Sau 9 giờ lên men xác định mật độ B. bifidum tại từng nghiệm thức.
Chỉ tiêu đánh giá
38
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến sữa chua synbiotic theo thời gian bảo quản bảo quản
Mục đích
Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến mật độ B. bifidum, pH và độ chua theo thời gian bảo quản 4 tuần.
Bố trí thí nghiệm
Theo kết quả có được từ các thí nghiệm ở mục 2.2.3 mà xác định được thứ tự cấy giống và hàm lượng WPC bổ sung vào nguyên liệu tối ưu cho quá trình này.
Chuẩn bị thí nghiệm
- Giống: L. bulgaricus, S. thermophilus, B. bifidum
- Môi trường lên men được bổ sung WPC theo hàm lượng tối ưu được xác định tại mục 2.2.3b và môi trường lên men không bổ sung WPC làm mẫu đối chứng.
- Chuẩn bị 4 mẫu chứa 100ml môi trường lên men/mẫu, trong đó có 2 mẫu bổ sung WPC ở hàm lượng tối ưu và 2 mẫu không bổ sung WPC (mẫu đối chứng).
Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị giống theo mục 2.2.2.
- Bổ sung 1% giống B. bifidum và 2% giống khởi động.
- Theo dõi mật độ B. bifidum, pH, độ chua theo thời gian bảo quản tại 0 ngày, 1 ngày, 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày, 28 ngày cho mẫu có bổ sung hàm lượng WPC tối ưu và mẫu đối chứng.
Chỉ tiêu đánh giá
39
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của WPC đến mật độ B. bifidum khi áp dụng phương pháp sấy phun tạo bột sữa chua synbiotic.
Mục đích
Khảo sát ảnh hưởng của WPC với hàm lượng bổ sung được tối ưu ở các thí nghiệm trước đến mật độ B. bifidum khi áp dụng phương pháp sấy phun tạo bột sữa chua synbiotic.
Bố trí thí nghiệm
Trong thí nghiệm này có 2 nghiệm thức có bổ sung WPC và không bổ sung WPC với các thông số tối ưu được cố định ở các thí nghiệm trước.
Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị 2 mẫu (1lít/mẫu) có bổ sung và không bổ sung WPC theo như thí nghiệm ở mục 2.2.4.
- Hai mẫu sữa chua trên được khuấy kỹ (để phá cấu trúc gel, giảm độ nhớt, tránh làm nghẹt vòi phun).
- Thực hiện sấy phun 2 mẫu bằng máy sấy phun Mini Spray Dryer – Yamoto với các thông số sau:
+ Lưu lượng dịch phun: 2cm3
/giây + Áp suất phun: 2kg/cm3
+ Nhiệt độ đầu vào: 90 – 100o
C + Nhiệt độ đầu ra: 40 – 45oC
- Hai mẫu sau khi sấy phun được xác định mật độ B. bifidum.
Chỉ tiêu đánh giá
Mật độ B. bifidum, độ ẩm và tỷ lệ sống của B. bifidum.
Tỷ lệ sống (%) được xác định theo công thức: (log(N)/log(N0 f))100 Trong đó: N là mật độ tế bào sau sấy phun (CFU/g)
N0 là mật độ tế bào trước sấy phun (CFU/ml).
40
2.3 Phƣơng pháp phân tích
2.3.1. Phương pháp vi sinh
a. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram
Dựa vào khả năng bắt khác nhau của vi khuẩn Gram âm và Gram dương quy định bởi vách tế bào. Vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu tím do có lớp peptidoglycan dày, vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng do lớp peptidoglycan ít hơn.
Thực hiện tiêu bản nhuộm Gram với cả 3 chủng giống. Quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x100. Ghi nhận sự bắt màu, hình dạng tế bào.
b. Phương pháp định lượng bằng cách đếm khuẩn lạc
Các mẫu sữa chua synbiotic và bột sữa chua synbiotic được pha loãng theo hệ thập phân bằng nước muối sinh lý trước khi cấy trải trên các môi trường. B. bifidum được định lượng trên môi trường thạch LP – MRS ở 37oC trong 72 giờ.
2.3.2. Phương pháp hóa lý
a. Xác định pH của sữa chua
pH của sữa chua được đo bằng máy đo pH Eutech instruments pH 510. b. Xác định độ chua trong sữa chua
Độ chua oT của sữa chua là số ml NaOH 0,1N cần để trung hòa 100ml sữa chua trong 200ml nước cất.[4]
Phương pháp thực hiện
Lấy 10ml sữa chua và 20ml nước cất cho vào erlen, lắc đều và cho vài giọt thuốc thử phenolphthalein. Định lượng bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi dung dịch chuyển màu hồng.
41
3.1. Kiểm tra đặc điểm sinh học của giống
3.1.1. Quan sát hình thái đại thể và vi thể
Giống khởi động có nguồn gốc từ bộ sưu tập giống của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM được cung cấp đầy đủ thông tin về hình thái và đặc điểm đại thể, vi thể.
Giống B. bifidum trước khi sử dụng lên men được cấy tạo khuẩn lạc đơn trên môi trường chọn lọc riêng biệt để kiểm tra độ đồng nhất, sau đó nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào.
Hình thái và đặc điểm cụ thể của các giống được miêu tả trong hình 3.1, hình 3.2 và bảng 3.1.
(a) (b)
(c)
Hình 3.1. Hình thái đại thể của giống khởi động và B. bifidum trên các môi trường đặc trưng
42
(a) (b)
(c)
Hình 3.2. Hình thái vi thể của giống khởi động và B. bifidum (X100) (a) S. thermophilus, (b) L. bulgaricus, (c) B. bifidum
Bảng 3.1. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng vi khuẩn sử dụng lên men sữa chua
Chủng Đặc điểm đại thể Đặc điểm
vi thể
Môi trƣờng H nh dạng
L. bulgaricus MRS - acid Chấm tròn nhỏ, màu trắng trong, bề mặt bóng Hình que dài, kết chuỗi S. thermophilus M17 Chấm tròn nhỏ, màu trắng trong hơi trắng đục ở giữa, bề mặt bóng Hình bầu dục, kết chuỗi B. bifidum MRS-LP Tròn, đường kính khoảng 0,5 – 1,5mm, màu trắng đục, bóng, hơi lồi Hình que ngắn, kết đôi và kết chuỗi Hình chữ V
43
3.1.2. Khảo sát đường cong sinh trưởng của B. bifidum
Quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật ở điều kiện nuôi cấy tĩnh gồm 4 pha là pha lag, pha log, pha cân bằng, pha suy vong. Trong lên men, tùy thuộc mục đích sử dụng mà người ta sẽ dừng nuôi cấy vi sinh vật ở thời điểm nhất định [4]. Do vậy việc khảo sát đường cong sinh trưởng của chúng là rất cần thiết.
Tiến hành theo dõi sự sinh trưởng của B. bifidum trên môi trường MRS dịch thể ủ 37oC. Mật độ B. bifidum được theo dõi sau mỗi 2 giờ nuôi cấy bằng cách đo OD600, từ giá trị OD đo được suy ra mật độ dựa vào đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ đã được dựng sẵn. Kết quả sinh trưởng được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2.Sự thay đổi mật độ của B. bifidum trên môi trường MRS dịch thể theo thời gian Thời gian (giờ) Mật độ Thời gian (giờ) Mật độ
Log (CFU/ml) CFU/ml Log(CFU/ml) CFU/ml
0 7,99 9,77x107 18 9,45 2,82x109 2 8,04 1,10x108 20 9,41 2,57x109 4 8,55 3,55x108 22 9,39 2,45x109 6 8,83 6,76x108 24 9,40 2,51x109 8 9,05 1,12x109 26 9,39 2,45x109 10 9,11 1,29x109 28 9,28 1,91x109 12 9,17 1,48x109 30 9,21 1,62x109 14 9,27 1,86x109 32 9,13 1,35x109 16 9,38 2,40x109
Dựa trên đường cong sinh trưởng của B. bifidum có thể thấy rằng pha lag kéo dài trong khoảng 2 giờ đầu tiên. Trong giai đoạn này, vi khuẩn thích nghi với môi trường, mật độ đạt 7,99 log (9,77x107 CFU/ml). Pha log kéo dài khoảng 16 giờ (từ 2 giờ đến 18 giờ). Tế bào sinh trưởng, phát triển mạnh và đạt cực đại ở thời điểm
44 18 giờ với mật độ 9,45 log (2,82x10 CFU/ml). Pha cân bằng kéo dài từ thời điểm 18 giờ đến 26 giờ. Ở giai đoạn này, tế bào ở trạng thái cân bằng động nên mật độ tế bào có tăng giảm nhưng luôn ổn định. Ở thời điểm 28 giờ mật độ tế bào có hiện tượng giảm mạnh từ 9,39 log xuống 9,28 log. Chứng tỏ ở thời điểm này vi khuẩn bắt đầu đi vào pha suy vong. Một phần do nguồn dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt và một phần do quá trình lên men đường tạo acid làm giảm pH trong môi trường nên ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
7.8 8.1 8.4 8.7 9 9.3 9.6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Thời gian (giờ)
Lg ( C FU /m l)
Đồ thị 3.1.Đường cong sinh trưởng của B. bifidum trên môi trường MRS
Vậy, với mục đích thu sinh khối B. bifidum bổ sung trong quá trình lên men sữa chua probiotic, ta chọn thời điểm dừng nhân giống thu sinh khối ở 18 giờ với mật độ tế bào đạt 2,82x109
(CFU/ml).
3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến pH, độ chua và mật độ
B. bifidum trong quá tr nh lên men sữa chua probiotic
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thứ tự cấy giống đến pH, độ chua và mật độ của B. bifidum trong quá trình lên men sữa chua probiotic
Trong các sản phẩm lên men từ sữa, giống khởi động không chỉ ức chế các vi sinh vật gây hại mà còn ức chế cả vi khuẩn probiotic. Chúng sản xuất ra bacteriocin, acid lactic, các acid hữu cơ khác và hydrogen peroxide để ức chế các vi sinh vật khác. Thêm vào đó, giống khởi động tăng trưởng nhanh hơn vi khuẩn
45 probiotic, cạnh tranh mạnh mẽ về nguồn dinh dưỡng. Vì vậy vi khuẩn probiotic chưa kịp tăng trưởng đã bị ức chế [23]. Trong sữa chua, sự tương tác sinh học giữa các chủng vi khuẩn trong cùng môi trường là rất phức tạp. Ngoài quá trình cộng sinh giữa Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus thermophilus, còn có quá trình tác động của giống khởi động lên vi khuẩn probiotic. Mặt khác, giống khởi động lại đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp hương vị đặc trưng của sữa chua truyền thống [23]. Tuy nhiên, giống khởi động lại yếu hoạt tính probiotic và nhạy cảm với các stress của điều kiện kỹ thuật như nhiệt độ cao, áp suất cao. Do đó vi khuẩn probiotic phải được lên men chung với giống khởi động. Chủng vi khuẩn probiotic sử dụng trong đề tài là một chủng đã được chứng minh có hoạt tính probiotic cao [21] và có khả năng chịu nhiệt. Có nhiều phương pháp để hạn chế sự ức chế của chúng lên vi khuẩn probiotic. Theo nghiên cứu của Shah và cộng sự (1997), lên men hai bước là một kỹ thuật đơn giản nhưng hiệu quả. Đây là kỹ thuật lên men 2 giai đoạn, giai đoạn đầu bổ sung vi khuẩn probiotic, sau 2 giờ bổ sung thêm giống khởi động và tiếp tục quá trình lên men. Ở thí nghiệm này chúng tôi cố định tổng thời gian lên men là 9 giờ.
Thời điểm kết thúc lên men thường được xác định bởi giá trị pH [27]. Bên cạnh đó theo TCVN 7030:2002 thì độ chua của sữa chua phải đạt từ 75 – 140 (oTh). Hơn nữa mục tiêu đề tài là tạo sữa chua probiotic nên chỉ tiêu quan trọng nhất là mật độ B. bifidum. Vì vậy, trong thí nghiệm này cả 3 chỉ tiêu trên đều được theo dõi để đánh giá.
46
Đồ thị 3.2. Sự thay đổi pH dưới ảnh hưởng của thứ tự cấy giống
Từ đồ thị 3.2 cho thấy thời gian lên men càng dài thì pH càng giảm. Tại thời điểm kết thúc quá trình lên men, pH ở nghiệm thức bổ sung B. bifidum trước (2-1) đạt 4,8, còn ở nghiệm thức bổ sung giống khởi động trước (2-2) là 5,11. Ở nghiệm thức 2-1 ta thấy pH giảm chậm trong 2 giờ đầu tiên vì đây là khoảng thời gian B. bifidum thích nghi với môi trường và ở 5 giờ tiếp theo (từ 2 - 7 giờ) pH giảm nhanh hơn do thời gian này B. bifidum đang tăng trưởng đồng thời giống khởi động được bổ sung vào nên acid lactic tích lũy trong môi trường nhiều. Còn ở nghiệm thức 2-2 thì ngược lại khoảng 4 giờ đầu tiên pH giảm nhanh do giống khởi động thích nghi, tăng trưởng và tạo sản phẩm trao đổi chất mà chủ yếu là acid lactic và 3 giờ tiếp theo thì pH giảm chậm lại vì đây là thời điểm bổ sung thêm B. bifidum nên có sự cạnh tranh mạnh mẽ về dinh dưỡng và ức chế giữa các chủng vi khuẩn. Từ thời điểm 7 – 9 giờ, khi pH đạt gần bằng 5 không còn sự khác biệt đáng kể giữa 2 nghiệm thức. Vì theo những nghiên cứu trước đây thì B. bifidum sống được trong môi trường có pH lớn hơn 5. Với giá trị pH nhỏ hơn 5 vi sinh vật này