3.3.1. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng
Trồng ngô trên đất thịt nhẹ, độ màu mỡ cao, dễ thoát nƣớc, đủ ẩm nhƣng không bị úng.Trong nhà lƣới, ở mỗi ô đất ngô đƣợc gieo thành 2 hàng, cách nhau 50 – 60 cm, khoảng cách giữa các hạt ngô trong 1 hàng từ 10 – 15 cm (hình 3.1). Vị trí gieo mỗi dòng ngô đƣợc đánh dấu bằng 1 cọc treo thẻ ghi tên dòng ngô. Khi cây ngô đƣợc 3 - 4 lá tiến hành treo thẻ tên từng cây (tên thẻ = tên đầu dòng + số thứ tự cây ngô của dòng đƣợc gieo).
Quy trình kỹ thuật
- Trồng ngô: Mỗi dòng ngô chuyển gen thí nghiệm gieo 30 hạt trên nền đất
thịt nhẹ, độ màu mỡ cao, dễ thoát nƣớc, đủ ẩm nhƣng không bị úng. Mỗi ô đất đƣợc gieo thành 2 hàng cách nhau 50 – 60 cm, khoảng cách giữa các hạt ngô trong 1 hàng từ 10 – 15 cm. Vị trí gieo mỗi dòng ngô đƣợc đánh dấu bằng 1 cọc treo thẻ ghi tên dòng ngô. Khi cây ngô đƣợc 3 - 4 lá tiến hành treo thẻ tên từng cây (tên thẻ = tên đầu dòng + số thứ tự cây ngô của dòng đƣợc gieo). - Chăm sóc:
1. Phân bón:
Bón phân hữu cơ và vô cơ với liều lƣợng nhƣ sau:
Phân chuồng (tấn/ha)
Đạm (kg/ha) Lân (kg/ha) Kali (kg/ha) N Urê P2O5 Superlân K2O KCl 8-10 120 - 150 260 - 326 75 - 90 440 - 530 60 - 90 100 - 150 Thời điểm bón, cách bón:
Bón lót: 10 tạ phân chuồng + 100% phân lân.
Bón thúc 1 (Khi cây ngô có 3 - 4 lá): Bón 20% đạm + 20% kali, cách
Bón thúc 2 (Khi cây ngô có 7 - 8 lá): Bón 40% đạm + 40% kali, cách gốc 15cm.
Bón thúc 3 (Khi cây ngô xoáy nõn): Bón 40% đạm + 40% kali, cách
gốc 15 -20cm.
Luôn để đất tơi xốp và giữ ẩm, xới phá váng sau mƣa vào kỳ cây con. Vun gốc vừa kết hợp làm cỏ sau khi bón thúc đợt 1, vun cao gốc kết hợp làm cỏ lần cuối cho ngô khi bón thúc lần 2.
Tưới nước: 3 lần
Lần 1: khi cây 7-9 lá tƣới ngập 1/3 luống sau khi bón thúc
Lần 2: trƣớc trổ cờ 10-15 ngày tƣới ngập 2/3 luống thấm đều rồi rút cạn.
Lần 3: sau thụ phấn xong tƣới ngập 1/3 luống rồi rút cạn.
2. Thụ phấn
Bao kín hoa cái (bắp ngô) bằng bao cách ly.
Dùng bao cách ly chùm kín hoa đực (cờ ngô), rung nhẹ cho hạt phấn
rơi vào bao.
Rắc hạt phấn thu đƣợc lên đầu nhụy (râu ngô) của hoa cái, ghi rõ ngày
tháng thụ phấn.
Trong quá trình thụ phấn tránh dính bết râu ngô, không thụ phấn quá nhiều, thụ phấn khi trời khô ráo, lặng gió, thƣờng vào buổi sáng (mùa hè 9- 10h).
Thu mẫu:
* Thu mẫu lá các dòng ngô HR9 mang gen kháng sâu Cry1A(c) làm vật
liệu cho tách chiết DNA tổng số. Tiến hành thu mẫu lá ngô khi cây đƣợc 4 lá, chọn lá non sau đó bảo quản trong N2 lỏng. Sau đó mẫu sẽ đƣợc bảo quản trong tủ lạnh sâu (-800C) để sử dụng lâu dài
* Thu mẫu hạt các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T2: Thời điểm thu hoạch tốt nhất là khi ngô chín già, bắp có lá bị chín vàng (râu ngô khô, đen, bẹ ngô chuyển từ màu xanh sang màu vàng rơm)
Chọn ngày khô ráo, nắng để thu hoạch ngô nhằm hạn chế ngô bị ƣớt do mƣa. Tiến hành thu bắp, làm khô bắp, làm khô hạt. Hạt sẽ đƣợc tẽ cho vào (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trong túi ngô theo từng dòng và bảo quản hạt trong kho lạnh (50C) để sử dụng
lâu dài.
3.3.2. Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Các chỉ tiêu nông sinh học đƣợc theo dõi, ghi số liệu vào bảng theo mẫu sau:
TT Dòng TGST Chiều cao cây (cm) Số lá Dài bắp (cm) Đƣờng kính bắp (cm) KL hạt/bắp (g) 1 2 3 . .
Bảng 3.2. Mẫu bảng ghi số liệu các chị tiêu theo dõi
Các số liệu chỉ tiêu nông sinh học mỗi dòng đƣợc lấy là giá trị trung bình (TB) của 30 hạt trồng mỗi dòng.
3.3.3. Phương pháp phân tích
Tách chiết DNA tổng số từ lá ngô
Tiến hành thu mẫu lá ngô khi cây đƣợc 4 lá để tách chiết DNA. DNA đƣợc tách chiết và tinh sạch theo phƣơng pháp CTAB của Saghai Maroof (1984) có cải tiến.
Chuẩn bị dung dịch đệm chiết: (CTAB) 100 ml CTAB gồm:
Dung dịch mẹ Lƣợng cần lấy cho 100 ml Nồng độ cuối cùng (100 ml) 1 M Tris-HCl (pH 8) 10ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8) 5 M NaCl 28 ml 1,4 M NaCl 1M EDTA (pH 8) 1 ml 10 mM EDTA (pH 8) - Thêm H20 đến 100 ml - Khử trùng 117oC thời gian 20 phút
- Bổ sung CTAB, PVP và ascorbic acid vào DEB sau khi khử trùng (bổ
sung khi dung dịch ở khoảng 65oC để hoà tan hết các chất này).
CTAB 2g ( 2% CTAB)
PVP 2g (2% PVP)
Ascorbic acid 88 mg (5 mM ascorbic acid)
- Bổ sung mercaptoethanol 100ul/100ml CTAB trƣớc khi dùng chuẩn bị
CTAB: ủ ở bể ổn nhiệt 65o
C.
- Nghiền khoảng 1 g mẫu lá ngô thành bột mịn trong N2 lỏng, chuyển
sang eppendorf 1,5 ml.
- Thêm 800ul đệm CTAB ở 65oC. Ủ ở bể ổn nhiệt 65oC ít nhất 1h.
- Ly tâm 15 phút với tốc độ 12.000 v/p thu dịch nổi
- Hút lớp dịch nổi sang ống mới.
- Thêm 25 : 24 : 1 theo tỷ lệ 1 : 1. Votex trong 10 -15 phút. Ly tâm 10 –
15 phút 12.000 – 13.000 v/p.
- Hút lớp dịch nổi + 24 : 1 theo tỷ lệ 1 : 1. Votex trong 10 phút. Ly tâm
15 phút ở 12.000 – 13.000 v/p.
- Hút lớp dịch nổi + isopropanol (tỷ lệ 1 : 1). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đƣa vào tủ - 20oC ủ qua đêm để thu đƣợc lƣợng kết tủa lớn nhất.
- Ly tâm thu tủa và rửa sạch bằng cồn 75o
ít nhất 2 lần.
- Thổi khô DNA đã rửa sạch và hòa tan bằng TE.
- Bổ sung 10 mg/l ARNase. Ủ ở bể ổn nhiệt 370
Phân tích PCR
Xác định sự có mặt của gen chuyển Cry1A(c) trong hệ gen thực vật bằng phản ứng PCR sử dụng các mồi đặc trƣng (bảng 3.3). Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với thể tích phản ứng 10 µl (gồm 1µl DNA (50 ng/1µl), 1µl dNTPs (2 mM), 1 µl đệm PCR (10X), 1 µl MgCl2 (25mM), 0,15 µl ADN mồi (25pM), 0,15 µl Taq polymerase (Fermentas, Đức) và 5,55 µl H2O).
- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR cho gen Cry1A(c): 1 chu kỳ ở 95°C – 3
phút; 30 chu kỳ: 95 °C - 1 phút, 58,5° C – 30s, 72°C – 90s; và 1 chu kỳ kết thúc ở 72 °C - 10 phút.
Bảng 3.3. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu
Đoạn mồi Trình tự
S-Cry1A(c)-F1 5’-ACAGAAGACCCTTCAATATC-3’
S-Cry1A(c)-R1 5’-GTTACCGAGTGAAGATGTAA-3’
- Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%
Chuẩn bị gel agarose 1%: cho 1g agarose vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1X. Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống
khoảng 50oC rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di đã cài sẵn lƣợc. Sau
khoảng 20 phút, khi gel đã đông, gỡ lƣợc ra, đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel từ 1-2 mm.
- Điện di sản phẩm khuyếch đại trên gel agarose (1%) ở hiệu điện thế
100 V, trong khoảng 25-30 phút. DNA di chuyển từ cực âm đến cực dƣơng. Quan sát sự di chuyển của màu bromophenolblue để biết khi nào cần dừng điện di. Nhuộm DNA bằng ethidium bromide (2ug/ml)
Xác định sự có mặt của protein Cry1A(c)
Đối với các cây chuyển gen có kết quả PCR dƣơng tính với gen
Cry1A(c), lấy mẫu lá, tiến hành xác định sự có mặt của protein Cry1A(c) bằng
phƣơng pháp que thử sử dụng Kit EnviroLogix QuickStix TM
Thu mẫu lá của 5 cây đƣợc chọn ngẫu nhiên từ mỗi dòng chuyển gen. Mẫu lá đƣợc nghiền nhỏ trong ống eppendorf bằng dung dịch tách chiết DNA. Sử dụng que thử nhanh đối với protein Cry1A(c) để xác định sự có mặt của protein này trong cây.
3.3.4. Đánh giá khả năng kháng sâu bằng phương pháp thử sâu trong nhà lưới
Các cây ngô đƣợc trồng trong điều kiện nhà lƣới chống côn trùng, loại trừ các yếu tố thiên địch. Sâu đục thân Châu Á Ostrinia do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp. Khi cây ngô từ 35 - 40 ngày tuổi, có 7-10 lá, tiến hành thả ổ ấu trùng sâu đục thân lên nõn lá trên cùng. Tiến hành thả sâu 3 lần, mỗi lần cách nhau 1 tuần, mỗi lần 10-15 ấu trùng/cây. Mật độ thả sâu cuối cùng: 30-50 ấu trùng/cây
* Quy tắc cho điểm kháng sâu: Dựa trên các chỉ tiêu trên lá và chỉ tiêu trên thân
Chỉ tiêu trên lá:
+ Xác định số lá bị hại
+ Số lƣợng lỗ đục lá trên cùng, so sánh với lá dƣới (lá đầu tiên bị hại) để xác định số lƣợng lỗ có chiều hƣớng tăng lên hay giảm xuống (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Kích thƣớc lỗ đục lá trên cùng (đo lỗ có kích thƣớc điển hình- tính bằng mm), so sánh với lá dƣới để xác định kích thƣớc lỗ có chiều hƣớng tăng lên hay giảm xuống
+ Các chỉ số trên lá đƣợc xác định trƣớc khi thu hoạch (khi lá còn xanh) Chỉ tiêu trên thân:
+ Xác định số lỗ đục trên thân
+ Đo đƣờng kính lỗ đục (theo chiều dài – tính bằng mm)
+ Đo chiều dài đƣờng đục trong thân (đo lỗ có đƣờng kính lớn nhất – tính bằng mm)
Sau đó tiến hành phân tích số liệu theo phƣơng pháp thống kê
Qui đổi số liệu:
Số liệu thí nghiệm đo đếm (có đơn vị đo lƣờng) đƣợc qui đổi về dạng
số không có đơn vị đo lƣờng
Số lƣợng đƣợc đồng nhất hóa về dạng số để phục vụ cho các thuật toán
thống kê phân tích thí nghiệm
Giá trị số liệu đƣợc chấm theo thang điểm năm, cách qui đổi đƣợc thực
hiện theo công thức
DLTB = (DL1*2 + DL2 + DL3) /4
Trong đó DL1: Là trị số qui đổi tƣơng ứng từ số lá bị hại
DL2: Là trị số qui đổi tƣơng ứng từ số lỗ đục lá trên cùng
DL3: Là trị số qui đổi tƣơng ứng từ kích thƣớc lỗ đục lá trên cùng
DLTB: là các trị số bình quân tƣơng ứng. điểm 5: đƣợc gọi là điểm chuẩn (cây không bị sâu hại)
3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc ghi chép, tổng hợp và tính toán thống kê dựa vào chƣơng trình phần mềm Excel 5.0.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân tích PCR sự có mặt của gen Cry1A(c) trong các dòng ngô HR9 chuyển gen chuyển gen
Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi đƣợc biến nạp vào tế bào có thể tồn tại trong tế bào chủ ở 3 trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dƣới dạng một thể plasmit độc lập tự nhân và (3) Ổn định nhƣ một đoạn DNA của genome trong tế bào chủ và đƣợc nhân lên theo dạng tƣơng hợp hay không tƣơng hợp. Đây là trạng thái mong muốn nhất khi tạo cây chuyển gen vì tính bền vững của thể biến nạp, nhƣng nó hoàn toàn phụ thuộc vào quá trình tái tổ hợp. Hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen thuộc nhân vẫn có thể phát hiện thấy hiện tƣợng nhân không tƣơng hợp đối với gen lạ khi vào DNA nhân do vị trí đoạn gen lạ đƣợc ghép nối ảnh hƣởng đến biểu hiện của chính nó hay gen chủ đích gần đó. Chính vì thế, các phƣơng pháp sinh học phân tử nhằm xác định sự có mặt của gen và biểu hiện của gen đó trong tế bào là bƣớc phân tích rất cần thiết.
Để xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào của các dòng ngô HR9 chuyển gen thế hệ T2, chúng tôi tiến hành phân tích PCR gen kháng sâu
Cry1A(c) trên các cây gieo trồng thuộc 6 dòng. Đối với mỗi dòng, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 30 cây để thu lá và tách chiết DNA sau đó tiến hành thí
nghiệm phân tích PCR gen kháng sâu Cry1A(c).
DNA tổng số đƣợc tách chiết từ mô lá cây ngô theo phƣơng pháp CTAB của Maroof (1984) có cải tiến.
Kết quả điện di kiểm tra mẫu DNA tổng số tách chiết đƣợc cho thấy chất lƣợng DNA tách chiết đạt độ tinh sạch, hàm lƣợng DNA thu đƣợc khá cao, đủ để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo (hình 4.1).
Hình 4.1. Kết quả điện di trên gel agarose 0,8 % kiểm tra mẫu DNA tổng số.
Sản phẩm DNA tổng số của các dòng ngô chuyển gen trên đƣợc sử dụng làm DNA khuôn cho phân tích PCR. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sử dụng cặp mồi S-Cry1A(c) kết quả cho thấy trong tổng số 180 cây của 6 dòng HR9 chuyển gen phân tích có 49 cây có kết quả dƣơng tính với
kích thƣớc băng AND thu đƣợc 600bp tƣơng ứng với gen Cry1A(c).
Bảng 4.1. Kết quả PCR phân tích các dòng ngô HR9 chuyển gen Cry1A(c)
STT Tên dòng T2 Số cây phân tích Số cây có kết quả PCR (+) Số cây có kết quả PCR (-) 1 HR9.14.49 30 23 7 2 HR9.20.21 30 17 13 3 HR9.34.20 30 3 27 4 HR9.32.92 30 0 30 5 HR9.34.42 30 6 24 6 HR9.32.93 30 0 30 7 HR9 – ĐC 3 0 3 Tổng số 183 49 134
Kết quả trên bảng 4.1 cho thấy trong số 6 dòng HR9 phân tích thì hai dòng HR9.32.92 và dòng HR9.32.93 không có cây nào cho kết quả dƣơng tính.
Đánh giá về tỷ lệ phân ly của gen chuyển ở thế hệ T2, chúng tôi nhận thấy trong số 6 dòng HR9 chuyển gen phân tích có 2 dòng HR9.14.49 và HR9.20.21 có sự phân ly của gen chuyển tƣơng ứng là ~3:1 và ~1:1, sự phân ly gen tuân theo quy luật di truyền của Mendel. Tỉ lệ phân ly ~1:1 là do trong
quá trình thụ phấn, cây mang gen chuyển Cry1A(c) thụ phấn với cây không
chuyển gen. Tỷ lệ phân ly ~3:1 tƣơng ứng khi các cây chuyển gen tự thụ phấn.
Các dòng có kết quả dƣơng tính này sẽ đƣợc tiến hành các phân tích tiếp theo. Kết quả PCR đƣợc thể hiện ở hình 4.2. Các cây cho kết quả PCR dƣơng tính trong hình là đại diện trong tổng số cây phân tích.
Hình 4.2. Kết quả phân tích PCR gen Cry1A(c) ở các cây chuyển gen dòng
HR9.14.49
Ghi chú: M: Marker 1kb
(+): đối chứng dƣơng (plasmid ADT2)
(-):đối chứng âm (cây HR9 không chuyển gen)
Các giếng 1, 4, 5, 6, 7, 9: các mẫu chuyển gen dƣơng tính với gen Cry1A(c) là các cây dòng HR9.14.49 dƣơng tính với gen Cry1A(c).
M (+) (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ô vuông đỏ: Các mẫu có kết quả PCR dƣơng tính với gen Cry1A(c)
4.2. Đánh giá sự có mặt của protein Cry1A(c) trong các dòng ngô HR9 chuyển gen chuyển gen
Chúng tôi tiến hành thu mẫu lá các cây T2 của các dòng có kết quả dƣơng tính với PCR để làm vật liệu cho phân tích sự có mặt của protein Cry1A(c). Tiến hành xác định sự có mặt của protein Cry1A(c) bằng phƣơng
pháp que thử sử dụng Kit EnviroLogix QuickStixTM
(Agdia, USA). Kết quả xác định sự có mặt của protein Cry1A(c) đƣợc trình bày ở bảng 4.3 dƣới đây. Bảng 4.2. Kết quả đánh giá sự hiện diện của protein Cry1A(c) trong các dòng
ngô HR9 chuyển gen kháng sâu thế hệ T2
STT Tên dòng T2 Số cây phân tích Số cây protein Cry1A(c) dƣơng tính Số cây protein Cry1A(c) âm tính Tỉ lệ có mặt protein 1 HR9.14.49 23 8 15 34,78 2 HR9.20.21 17 7 10 41,17 3 HR9.34.20 3 0 3 - 4 HR9.34.42 6 0 6 - HR9 (đ/c) 3 0 3 -
Kết quả trên bảng 4.2 cho thấy: Trong số 49 cây thuộc các dòng HR9 chuyển gen có kết quả PCR dƣơng tính thì chỉ có 15 cây có sự hiện diện của protein Cry1A(c) ở các dòng HR9.14.49 và HR9.20.21. Dòng HR9.20.21 có tỷ lệ có mặt protein Cry1A(c) cao hơn dòng HR9.14.49. Các dòng dƣơng tính này sẽ là đối tƣợng đƣợc quan tâm nhiều hơn trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 4.3 Kết quả đánh giá sự hiện diện protein Cry1A(c) trong
dòng ngô HR9.20.21 chuyển gen kháng sâu thế hệ T2
Ghi chú: trên que thử xuất hiện 1 vạch - không có protein
Cry1A(c) và 2 vạch - dương tính với protein Cry1A(c); Số1: đối
chứng âm (cây HR9 không chuyển gen);
4.3. Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân của các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) kháng sâu Cry1A(c) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dựa trên kết quả đánh giá sự hiện diện của protein Cry1A(c) trong các dòng ngô chuyển gen, chúng tôi tiếp tục tiến hành đánh giá khả năng kháng sâu của các dòng ngô chuyển gen trong điều kiện nhà lƣới chống côn trùng thông qua theo dõi và đo đếm các chỉ số trên lá và thân. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Đánh giá khả năng kháng sâu đục thân của các dòng ngô HR9
chuyển gen Cry1A(c)
TT Tên dòng thế hệ T2 Số cây bị hại nhiều Số cây bị hại ít Số cây không