Phƣơng pháp tách chiết DNA
DNA là phân tử có kích thƣớc lớn, do đó trong thao tác cần tránh mọi tác nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gẫy phân tử này.
Phƣơng pháp tách chiết cơ bản gồm 3 bƣớc [4] :
Bƣớc 1: Phá vỡ Thành tế bào, màng tế bào và màng nhân. Thƣờng
ngƣời ta nghiền tế bào, mô trong hỗn hợp chất tẩy (detergent nhƣ SDS, sarcosyl ) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu
là các protein. Mẫu đƣợc lắc thật mạnh trong dung dịch phenol và chloroform, dung dịch phenol : chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời hòa tan axit nucleic. Protein khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha
Dòng cây chuyển gen Trồng, thu vật liệu
Tách DNA, điện di, Phân tích PCR, xác định sự có
nƣớc có chƣa axit nucleic, sau khi li tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol : chloroform. Pha nƣớc có chứa axit nucleic đƣợc thu nhận lại.
Bƣớc 3: Tủa axit nucleic, mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận axit
nucleic dƣới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác để có thể hòa tan chúng trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Hai cách tủa thông dụng là :
Tủa trong ethanol (ethylic ancohol), việc tủa này đƣợc thục hiện trong môi trƣờng có lực ion cao (nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2,5 dung tích ethanol/1 dung tích mẫu), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa. Hầu nhƣ toàn bộ aixt nucleic đều tủa trong điều kiện trên[4].
Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phƣơng pháp trên là không cần sự hiện diện của muối, thể tích isopropanol/thể tích mẫu là 1/1. Các DNA có trọng lƣợng thấp không đƣợc tủa, do đó không thể loại chúng ra khi dung các tủa này.
Trong cả hai phƣơng pháp, axit nucleic sẽ đƣợc thu nhận lại bằng li tâm. Sau đó cặn tủa phải đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu.
Độ tính sạch của dịch chiết DNA đƣợc xác định qua tỷ số OD260nm/OD280nm, một dung dịch DNA đƣợc xem là tính sạch khi tỷ số này nằm trong khoảng 1,8 – 2[6].
2.5.2. Phương pháp điện di
Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng trong cả phân tích định tính lẫn trong việc thu nhận mẫu aixt nucleic[4].
Nguyên tắc của phƣơng của phƣơng pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các axit nucleic. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển
về cực dƣơng của điện trƣờng. Tính linh động của phân tử trong bản (gel) dƣới tác động của điện trƣờng đƣợc tính theo công thức:
Log u = Log u0 - KrC
Trong đó: Log U0 là tính linh động của phân tử trong môi trƣờng lỏng, Kr là hằng số làm chậm (retardation coefficient) do cấu trúc gel đồng thời cũng phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử của phân tử axit nucleic, C là nồng độ của gel.
Qua đó, ta thấy rằng tính linh động của phân tử phụ thuộc vào 2 chỉ tiêu : khối lƣợng phân tử tức là số lƣợng nucleotide hay cặp nucleotide (DNA mạch đôi) và nồng độ các chất cấu thành gel. Hai loại gel đƣợc sử dụng trong nghiên cứu axit nucleic là gel polyacrylamide và agarose. Việc chọn loại gel cũng nhƣ nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc vào kích thƣớc trung bình của các đoạn axit nucleic cần phân tách.
Gel agarose: đây là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thƣờng dùng để phân tách những đoạn có kích thƣớc trong khoảng 0,5 – 20kb. Gel đƣợc đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di đƣợc thực hiện theo phƣơng nằm ngang.
Các axit nucleic trong gel sẽ hiện hình dƣới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide. Chất này là một chất rất độc, gây đột biến và có khả năng gắn xen vào giữa các base của axit nucleic, dƣới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang[4],[18].
Để ƣớc lƣợng kích thƣớc của trình tự axit nucleic trong gel agarose, ngƣời ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lƣợng phân tử ” (MWM). Đó là tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thƣớc đã biết trƣớc (thang DNA – DNA ledder), thông thƣờng sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể λ đƣợc thủy giải bởi enzyme giới hạn HindIII[4].
Gel polyacrylamide: dùng để tách các đoạn có kích thƣớc nhỏ tức là
agarose. Do đó gel này chỉ đƣợc sử dụng cho những mục đích đặc hiệu. Các ứng dụng chủ yếu của loại gel này là[18] :
- Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp
- Xác định trình tự DNA
- Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dƣới 500 cặp base
Gel đƣợc đổ giữa 2 tấm thủy tinh và phƣơng pháp điện di là phƣơng pháp thẳng đứng.
Điện di trong trƣờng xung ( Pulse Field Gel Electrophoresis ): Loại điện di này sử dụng để phân tách các phân tử DNA rất lớn (>50kb), không thể phân tách đƣợc bằng gel agarose dù ở nồng độ tối thiểu là 0,4% (dƣới 0,4% gel quá mềm không thể thao tác đƣợc).
Nguyên tắc của loại điện di này dựa vào sự thay đổi hƣớng điện trƣờng trong quá trình điện di. Mỗi lần hƣớng điện trƣờng thay đổi thì phân tử DNA phải tự định hƣớng lại. Thời gian cần cho việc tự định hƣớng lại tùy thuộc vào kích thƣớc của phân tử, phân tử càng dài thì thời gian định hƣớng lại càng lớn khiến cho nó di chuyển chậm hơn một phân tử có kích thƣớc nhỏ[4].
Điện di trên gel agarose còn đƣợc sử dụng để tinh sạch và thu nhận mẫu. Nguyên tắc và các điều kiện kỹ thuật giống nhƣ ở điện di phân tích đã đề cập ở trên. Sau khi điện di, các vạch tƣơng ứng với DNA cần tinh sạch sẽ đƣợc thu lại theo một trong các phƣơng pháp sau :
Phƣơng pháp 1: Phần agarose chứa các vạch đó đƣợc cắt ra và DNA thu nhận sau khi đã khuếch tán từ gel agarose vào một dung dịch đệm thích hợp.
Phƣơng pháp 2: Một “giếng” nhỏ đƣợc khoét trong agarose ngay trƣớc vạch DNA. “Giếng” này đƣợc bơm đầy dung dịch đệm và điện trƣờng đƣợc tái lập. DNA di chuyển vào “giếng” chứa đầy dung dịch đệm và thu nhận lại.
Phƣơng pháp 3: Điện di thực hiện trong một gel agarose đặc biệt (nhƣ
Nusieve hay Seaplaque) có điểm nóng chảy rất thấp (650C). Sau điện di, vạch
DNA đƣợc cắt ra, ủ trong một dung dịch đệm ở nhiệt độ 650
C. Khi agarose đã hoàn toàn tan chảy, DNA đƣợc thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và kết tủa[4].
2.5.3. Phương pháp PCR
Nguyên tắc
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ xung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa vào đặc tính đó của các polymerase[8]. Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đƣợc đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ xung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngƣợc (atisens primer). Từ mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc” phải hiểu là : “xuôi” và “ngƣợc” so với chiều phiên mã của gen[4].
Các bƣớc của một chu kì PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kì (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm ba bƣớc[4] :
Bƣớc 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần
thiết cho sự sao chép, phân tử DNA biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân
tử, thƣờng là ở 94 – 950C trong vòng 30s đến 1 phút. Đây là gia đoạn biến
tính (denaturation).
Bƣớc 2 : Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép
khoảng 40–700C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30s – 1 phút. Đây đƣợc gọi là giai đoạn lai (Hybridization)[6].
Bƣớc 3 : Nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 72o
C giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là DNA polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30s đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp, hay kéo dài (elongation).
Trong phản ứng PCR, phân tử DNA đƣợc gây biến tính và sự tổng hợp DNA diễn ra lặp lại qua nhiều chu kỳ nhờ khả năng điều nhiệt của máy. Chúng ta có thể thu đƣợc hàng tỷ bản sao sau khoảng thời gian trên dƣới 30
CHƢƠNG 3. ĐỒI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian, địa điểm thí nghiệm.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ ngày 3/6/2014 đến 30/12/2014
Các thí nghiệm đồng ruộng đƣợc thực hiện tại Trạm thực nghiệm Văn Giang, thuộc Viện Di Truyền Nông Nghiệp nằm ở địa bàn xã Liên Nghĩa, huyện Văn Giang, tỉnh Hƣng Yên.
Các thí nghiệm phân tích sinh học phân tử đƣợc thực hiện tại: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công Nghệ Tế Bào Thực Vật – Viện Di Truyền Nông Nghiệp - đƣờng Phạm Văn Đồng – Cổ Nhuế - Bắc Từ Liêm – Hà Nội.
3.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Hạt T1 của các dòng ngô HR9 chuyển gen kháng sâu Cry1A(c) do
phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp. Các dòng trồng đánh giá đƣợc chọn với số lƣợng nhƣ bảng 3.1.
Bảng 3.1. Danh sách các dòng ngô sử dụng trong nghiên cứu TT Tên dòng T1 Số hạt trồng 1 HR9.14.49 30 2 HR9.20.21 30 3 HR9.34.20 30 4 HR9.34.42 30 5 HR9.32.92 30 6 HR9.32.93 30
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng
Trồng ngô trên đất thịt nhẹ, độ màu mỡ cao, dễ thoát nƣớc, đủ ẩm nhƣng không bị úng.Trong nhà lƣới, ở mỗi ô đất ngô đƣợc gieo thành 2 hàng, cách nhau 50 – 60 cm, khoảng cách giữa các hạt ngô trong 1 hàng từ 10 – 15 cm (hình 3.1). Vị trí gieo mỗi dòng ngô đƣợc đánh dấu bằng 1 cọc treo thẻ ghi tên dòng ngô. Khi cây ngô đƣợc 3 - 4 lá tiến hành treo thẻ tên từng cây (tên thẻ = tên đầu dòng + số thứ tự cây ngô của dòng đƣợc gieo).
Quy trình kỹ thuật
- Trồng ngô: Mỗi dòng ngô chuyển gen thí nghiệm gieo 30 hạt trên nền đất
thịt nhẹ, độ màu mỡ cao, dễ thoát nƣớc, đủ ẩm nhƣng không bị úng. Mỗi ô đất đƣợc gieo thành 2 hàng cách nhau 50 – 60 cm, khoảng cách giữa các hạt ngô trong 1 hàng từ 10 – 15 cm. Vị trí gieo mỗi dòng ngô đƣợc đánh dấu bằng 1 cọc treo thẻ ghi tên dòng ngô. Khi cây ngô đƣợc 3 - 4 lá tiến hành treo thẻ tên từng cây (tên thẻ = tên đầu dòng + số thứ tự cây ngô của dòng đƣợc gieo). - Chăm sóc:
1. Phân bón:
Bón phân hữu cơ và vô cơ với liều lƣợng nhƣ sau:
Phân chuồng (tấn/ha)
Đạm (kg/ha) Lân (kg/ha) Kali (kg/ha) N Urê P2O5 Superlân K2O KCl 8-10 120 - 150 260 - 326 75 - 90 440 - 530 60 - 90 100 - 150 Thời điểm bón, cách bón:
Bón lót: 10 tạ phân chuồng + 100% phân lân.
Bón thúc 1 (Khi cây ngô có 3 - 4 lá): Bón 20% đạm + 20% kali, cách
Bón thúc 2 (Khi cây ngô có 7 - 8 lá): Bón 40% đạm + 40% kali, cách gốc 15cm.
Bón thúc 3 (Khi cây ngô xoáy nõn): Bón 40% đạm + 40% kali, cách
gốc 15 -20cm.
Luôn để đất tơi xốp và giữ ẩm, xới phá váng sau mƣa vào kỳ cây con. Vun gốc vừa kết hợp làm cỏ sau khi bón thúc đợt 1, vun cao gốc kết hợp làm cỏ lần cuối cho ngô khi bón thúc lần 2.
Tưới nước: 3 lần
Lần 1: khi cây 7-9 lá tƣới ngập 1/3 luống sau khi bón thúc
Lần 2: trƣớc trổ cờ 10-15 ngày tƣới ngập 2/3 luống thấm đều rồi rút cạn.
Lần 3: sau thụ phấn xong tƣới ngập 1/3 luống rồi rút cạn.
2. Thụ phấn
Bao kín hoa cái (bắp ngô) bằng bao cách ly.
Dùng bao cách ly chùm kín hoa đực (cờ ngô), rung nhẹ cho hạt phấn
rơi vào bao.
Rắc hạt phấn thu đƣợc lên đầu nhụy (râu ngô) của hoa cái, ghi rõ ngày
tháng thụ phấn.
Trong quá trình thụ phấn tránh dính bết râu ngô, không thụ phấn quá nhiều, thụ phấn khi trời khô ráo, lặng gió, thƣờng vào buổi sáng (mùa hè 9- 10h).
Thu mẫu:
* Thu mẫu lá các dòng ngô HR9 mang gen kháng sâu Cry1A(c) làm vật
liệu cho tách chiết DNA tổng số. Tiến hành thu mẫu lá ngô khi cây đƣợc 4 lá, chọn lá non sau đó bảo quản trong N2 lỏng. Sau đó mẫu sẽ đƣợc bảo quản trong tủ lạnh sâu (-800C) để sử dụng lâu dài
* Thu mẫu hạt các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) thế hệ T2: Thời điểm thu hoạch tốt nhất là khi ngô chín già, bắp có lá bị chín vàng (râu ngô khô, đen, bẹ ngô chuyển từ màu xanh sang màu vàng rơm)
Chọn ngày khô ráo, nắng để thu hoạch ngô nhằm hạn chế ngô bị ƣớt do mƣa. Tiến hành thu bắp, làm khô bắp, làm khô hạt. Hạt sẽ đƣợc tẽ cho vào
trong túi ngô theo từng dòng và bảo quản hạt trong kho lạnh (50C) để sử dụng
lâu dài.
3.3.2. Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Các chỉ tiêu nông sinh học đƣợc theo dõi, ghi số liệu vào bảng theo mẫu sau:
TT Dòng TGST Chiều cao cây (cm) Số lá Dài bắp (cm) Đƣờng kính bắp (cm) KL hạt/bắp (g) 1 2 3 . .
Bảng 3.2. Mẫu bảng ghi số liệu các chị tiêu theo dõi
Các số liệu chỉ tiêu nông sinh học mỗi dòng đƣợc lấy là giá trị trung bình (TB) của 30 hạt trồng mỗi dòng.
3.3.3. Phương pháp phân tích
Tách chiết DNA tổng số từ lá ngô
Tiến hành thu mẫu lá ngô khi cây đƣợc 4 lá để tách chiết DNA. DNA đƣợc tách chiết và tinh sạch theo phƣơng pháp CTAB của Saghai Maroof (1984) có cải tiến.
Chuẩn bị dung dịch đệm chiết: (CTAB) 100 ml CTAB gồm:
Dung dịch mẹ Lƣợng cần lấy cho 100 ml Nồng độ cuối cùng (100 ml) 1 M Tris-HCl (pH 8) 10ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8) 5 M NaCl 28 ml 1,4 M NaCl 1M EDTA (pH 8) 1 ml 10 mM EDTA (pH 8) - Thêm H20 đến 100 ml - Khử trùng 117oC thời gian 20 phút
- Bổ sung CTAB, PVP và ascorbic acid vào DEB sau khi khử trùng (bổ
sung khi dung dịch ở khoảng 65oC để hoà tan hết các chất này).
CTAB 2g ( 2% CTAB)
PVP 2g (2% PVP)
Ascorbic acid 88 mg (5 mM ascorbic acid)
- Bổ sung mercaptoethanol 100ul/100ml CTAB trƣớc khi dùng chuẩn bị
CTAB: ủ ở bể ổn nhiệt 65o
C.
- Nghiền khoảng 1 g mẫu lá ngô thành bột mịn trong N2 lỏng, chuyển
sang eppendorf 1,5 ml.
- Thêm 800ul đệm CTAB ở 65oC. Ủ ở bể ổn nhiệt 65oC ít nhất 1h.
- Ly tâm 15 phút với tốc độ 12.000 v/p thu dịch nổi
- Hút lớp dịch nổi sang ống mới.
- Thêm 25 : 24 : 1 theo tỷ lệ 1 : 1. Votex trong 10 -15 phút. Ly tâm 10 –
15 phút 12.000 – 13.000 v/p.
- Hút lớp dịch nổi + 24 : 1 theo tỷ lệ 1 : 1. Votex trong 10 phút. Ly tâm
15 phút ở 12.000 – 13.000 v/p.
- Hút lớp dịch nổi + isopropanol (tỷ lệ 1 : 1).
- Đƣa vào tủ - 20oC ủ qua đêm để thu đƣợc lƣợng kết tủa lớn nhất.
- Ly tâm thu tủa và rửa sạch bằng cồn 75o
ít nhất 2 lần.
- Thổi khô DNA đã rửa sạch và hòa tan bằng TE.
- Bổ sung 10 mg/l ARNase. Ủ ở bể ổn nhiệt 370
Phân tích PCR