CC, silica gel n hexan-EtOAc 9:
3.5 CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP
Từ các phần chiết lá cây Vông nem các hợp chất 1-octacosanol (M) và β- sitosterol (C) (EL1), apigenin (A) (EL2) và vitexin (R) (EL3) đã được phân lập.
Từ các phần chiết vỏ thân cây Vông nem (EB1) các hợp chất 1-octacosanol (M), β-sitosterol (C), soyasapogenol B (H), scandenon (T) và 6,8-điprenylgenistein (X) đã được phân lập.
Từ phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) các hợp chất 1-octacosanol (M), β-sitosterol (C) và soyasapogenol B (H) đã được phân lập.
1-Octacosanol (M)
Hợp chất M được phân lập bằng sắc ký cột dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,57 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 5:1).
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất (M) cho các tín hiệu cộng hưởng từ proton ở δH 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz) của một nhóm metyl liên kết với một nhóm metylen, tín hiệu dải rộng của các nhóm metylen của một mạch ankyl ở δH 1,18-1,36 và một nhóm –CH2-CH2-OH liên kết với mạch ankyl [δH 1,55 (1H, quintet, J = 7,0 Hz, H2- 2) và 3,63 (2H, dt, J = 5,5 Hz, 6,5 Hz, H2-1)]. Chiều dài của mạch ankyl đã được xác định là 25 nhóm metylen dựa trên tỷ lệ các đường cong tích phân trên phổ 1H- NMR. Trên cơ sở phổ 1H-NMR, chất M đã được xác định là 1-octacosanol (CH3- (CH2)26-CH2-OH). 1-Octacosanol là thành phần của sáp lá thực vật như của
Triticum aestirum (Gramineae) và Beta vulgaris (Chenopodiaceae).
Apigenin (A)
Hợp chất A được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, Rf = 0,88 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 10:1).
910 10 8 5 7 6 2 3 O 4 4' 5' 3' 6' 2' 1' OH O O H OH A
Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) của chất A cho các tín hiệu cộng hưởng từ proton của một vòng benzen thế 1,4 [δH 6,92 (2H, d, J = 9,0 Hz) và 7,91 (2H, d, J = 9,0 Hz)], các proton ở vị trí meta so với nhau của một vòng benzen thế 4 lần [δH 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 6,47 (1H, d, J = 2,0 Hz)]. Các dữ kiện phổ này cùng với sự xuất hiện của một tín hiệu singlet ở δH 12,95 của một nhóm hiđroxi liên kết hiđro, có thể là với một nhóm cacbonyl ở C-4 đã cho giả thiết về một cấu trúc flavonoit cho chất A. Sự xuất hiện của tín hiệu proton đặc trưng ở H-3 của một flavon [δH 6,76 (s)] đã xác định A là apigenin (4',5,7-trihiđroxiflavon) [6].
Apigenin là một tác nhân kháng khuẩn, chống viêm và chất ức chế nhiều enzyme. Apigenin cũng là aglycon của nhiều hợp chất glycosid từ thực vật.
β-Sitosterol (C)
Hợp chất C được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 135-136oC, Rf = 0,3 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 10:1).
OH H
C
Hợp chất này được nhận dạng là β-sitosterol trên cơ sở so sánh TLC và co- TLC với chất chuẩn β-sitosterol.
Vitexin (R)
Hợp chất R được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt.
Hợp chất R đã được xác định là một flavon C-glucosid dựa trên các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) của hợp chất R cho các tín hiệu proton của 2 doublet tương tác octo với nhau [δH 6,89 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz)]; các tín hiệu này được gán tương ứng cho các vị trí H-3'/H-5' và H-2'/H-6' của vòng B, một singlet của H-3 [δH 6,77 (1H, s)], một singlet của một proton duy nhất của vòng A [δH 6,28 (1H, s)] và các tín hiệu ở trường thấp của nhóm 5-OH tạo liên kết hiđro với nhóm cacbonyl ở C-4 và một proton anomeric của một gốc đường [δH 4,69 (1H, d, J = 10,0 Hz)]. So sánh các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 của chất R với của apigenin đã xác định được chất R là một apigenin C-glucosid [29]. Các sự thay đổi độ chuyển dịch hóa học quan sát được chủ yếu ở C-7 (∆δC -1,6), C-8 (∆δC +10,0) và C-9 (∆δC -1,4). Gốc đường đã được xác định là một nhóm glucopyranosyl dựa trên các phổ 13C-NMR và DEPT [δC 61,3 (t), 70,5 (d), 70,8 (d), 73,4 (d), 78,6 (d) và 81,8 (d)]. Các giá trị δC đã hoàn toàn xác định khả năng liên kết của nhóm glucopyranosyl vào C-8 của vòng A của apigenin [6], gây ra sự chuyển dịch δC ở các vị trí C-7, C-8 và C-9. Trên cơ sở các dữ kiện phổ hợp chất R đã được xác định là apigenin 8-C-β-D-glucopyranosid (vitexin) [5]. Cấu hình β của proton anomeric đã được xác định từ hằng số J = 10,0 Hz.
Phổ ESI-MS của chất R cho pic ion ở m/z 433,67 ([M + H]+) phù hợp với khối lượng phân tử của vitexin (C21H20O10).
OHO O O O H OH Glc 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 2 ' 3 ' 4 ' 5 ' 6 ' 1 '
Soyasapogenol B (H)
Hợp chất H được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 257-258oC, Rf = 0,16 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 4:1).
105 5 1 4 2 3 8 7 9 6 13 14 12 11 17 16 18 15 21 22 20 19 O H OH O H 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 H
Trên phổ 1H-NMR (CDCl3 và CD3OD) xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng từ proton của 7 nhóm metyl bậc ba (7s) [δH 0,85; 0,91; 0,92; 0,95; 1,03; 1,11 và 1,23], 2 nhóm oximetin [δH 3,39 và 3,41 (mỗi tín hiệu 1H, dd)], một nhóm hiđroximetylen dưới dạng 2 doublet AB [δH 3,32 và 4,19 (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 11,0 Hz)] và một nối đôi thế ba lần [δH 5,3 (1H, t, J = 3,5 Hz)].
Phổ 13C-NMR và DEPT (CDCl3 và CD3OD) của H cũng khẳng định các dữ kiện phổ 1H-NMR về 7 nhóm metyl bậc ba (7q) [δC 16,0; 16,8; 19,6; 22,3; 24,9; 28,2 và 32,2], 2 nhóm oximetin [δC 76,2 (d) và 80,3 (d)], một nhóm hiđroximetylen [δC 64,3 (t)] và một nối đôi thế ba lần [δC 122,3 (d) và 143,7 (s)]. Các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 còn lại trong số 30 tín hiệu được quan sát là 9 nhóm metylen (9t) [δC 18,3; 23,6; 25,7; 27,2; 28,4; 33,1; 38,3; 42,0 và 46,0], 3 nhóm metin (3d) [δC 44,9, 47,7 và 55,8] và 6 cacbon bậc 4 (6s) [δC 30,3; 36,6; 37,3; 39,5; 41,1 và 42,3].
Các dữ kiện phổ NMR đã giả thuyết cho một cấu trúc tritecpenoit olean-12- en của chất H. Sau đó, sự so sánh các giá trị độ chuyển dịch hóa học δH và δC của chất H với của mẫu chuẩn β-amyrin đã khẳng định cho cấu trúc này. Hơn nữa, một nhóm oximetin [δH 3,39 (1H, dd, J = 12 Hz, 4,5 Hz); δC 80,3 (d)] đã được xác định ở C-3 phù hợp với sự đóng vòng tritecpenoit đi từ oxidosqualen. Hóa lập thể của
nhóm 3-OH đã được xác định là β (equatorial) dựa trên hằng số tương tác Jax-ax = 12,0 Hz và δC 80,3. Nhóm hiđroximetin đã được xác định ở C-24 trên cơ sở so sánh các dữ kiện phổ 13C-NMR của H với các cấu trúc olean-12-en tương tự ở vòng A [27]. Việc xác định nhóm oximetin còn lại [δH 3,41 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 3,5 Hz); δC 76,2 (d)] dựa trên sự so sánh các độ chuyển dịch hóa học δC ở các vòng D/E và nhóm 28-CH3. Trong trường hợp nhóm hiđroxi được liên kết vào vị trí C-16 các giá trị δC tương ứng là khoảng 65,9 (C-16), 36,8 (C-17), 30,5 (C-22) và 21,3 (C-28) [9]. Các giá trị δC nhận được rõ ràng là được xác định cho nhóm hiđroximetin ở C-22, cụ thể là δC 76,2 (C-22), 37,3 (C-17), 28,4 (C-16) và 28,2 (C-28). Hóa lập thể của nhóm 22-OH đã được xác định là β (equatorial) dựa trên độ chuyển dịch hóa học δC 76,2 và các hằng số tương tác của H-22 (δH 3,41; J = 8,0 Hz, 3,5 Hz) (xem Hình 4).
Hình 4: Hóa lập thể của nhóm 22-OH
Các dữ kiện phổ NMR của H hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của soyasapogenol B [13].
Cuối cùng, các phổ 2 chiều (2D-NMR) bao gồm 1H-1H COSY, HSQC và HMBC đã được đo để khẳng định lại cấu trúc của hợp chất này. Trên phổ 1H-1H COSY với sự tham khảo phổ HSQC, các tương tác H-3 ↔ H2-1 ↔ H2-2, H5 ↔H2- 6↔ H2-7, H-9 ↔ H2-11 ↔ H2-12, H2-15 ↔ H2-16, H2-18 ↔ H2-19 và H2-21↔ H2- 22 đã được thiết lập. Vị trí của nhóm 3-OH cũng được xác định qua các tương tác HMBC giữa H-3 (δH 3,39) với C-3 (δC 80,3), giữa H3-23 (δH 1,23) và H2-24 (δH 3,32 và 4,19) với C-3. Vị trí của nhóm hiđroxi thứ hai đã được khẳng định nhờ phổ
22 21 21 CH3 CH3 H H H H OH C H3 CH3
HMBC ở C-22 qua các tương tác quan trọng giữa H-22 (δH 3,41) và C-20 (δC 30,3), giữa H-30 (δH 0,85) và C-22 (δC 76,2) và giữa H-22 và C-28 (δC 28,2).
Các tương tác 1H-1H COSY và HMBC quan trọng được biểu diễn trên Hình 5.
HO O H O H OH H
Hình 5: Các tương tác 1H-1H COSY ( ) và HMBC (→) quan trọng của chất H
Phổ ESI-MS của chất H cho pic ion ở m/z 459,09 ([M + H]+) phù hợp với khối lượng phân tử của soyasapogenol B (C30H50O3).
Scandenon (T)
Hợp chất T được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng lục, đ.n.c. 162-164oC, Rf = 0,44 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 5:1).