3.2.1. Khảo sát nguyên liệu
Mục đích: Đánh giá nguyên liệu trước khi thực hiện thí nghiệm để so sánh với k t quả sau khi dùng vi khuẩn phân giải.
Mẫu: Bã mía.
Các chỉ tiêu khảo sát: Hàm lượng vật chất khô, tro, hàm lượng xơ thô, hàm lượng hemicellulose, hàm lượng cellulose và hàm lượng lignin.
a) Hàm lƣợng vật chất khô (DM)
Nguyên tắc: Dùng nhiệt làm bay hơi nước có trong nguyên liệu. Phần còn lại là vật chất khô của nguyên liệu (AOAC, 1993).
Tiến hành
Sấy 2g b mía ở 70o
C cho tới khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích.
Hàm lượng vật chất khô được tính theo công thức:
X = m1*100/m (%)
Trong đó
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g) m1: Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g)
(*Nguồn: AOAC, 1993)
b) Hàm lƣợng hemicellulose (Neutral Detergent Fiber-NDF, Acid Detergent Fiber-ADF)
Nguyên tắc: dựa trên sự chênh lệch giữa 2 chỉ số NDF và ADF (Reed và Van Soest, 1985).
Tiến hành
Hàm lƣợng NDF (Neutral Detergent Fiber)
1g b mía được x lý hoàn lưu với dung dịch trung tính NDF, n-octanol và Na2SO3 với nhiệt trong 60 phút. Sau đó r a 3 lần với nước nóng và 2 lần với acetone. Sấy mẫu thu được ở 70o
C cho tới khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích.
Hàm lượng NDF được tính theo công thức:
X1 = m1*100/m (%)
Trong đó
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g) m1: Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g)
X1: Phần trăm NDF trong mẫu phân tích (%)
(*Nguồn: Van Soest và Wine, 1967)
Hàm lƣợng ADF (Acid Detergent Fiber)
1g b mía được x lý hoàn lưu với dung dịch acid và n-octanol với nhiệt trong 60 phút. R a 3 lần với nước nóng và 2 lần với acetone. Sấy mẫu thu được ở 70oCcho tới khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích.
Hàm lượng ADF được tính theo công thức:
X2 = m2*100/m (%)
Trong đó
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g) m2: Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g)
X2: Phần trăm ADF trong mẫu phân tích (%)
(*Nguồn: Van Soest và Robertson, 1979)
X = X1 – X2 (%)
Trong đó
X1: Phần trăm NDF trong mẫu phân tích (%) X2: Phần trăm ADF trong mẫu phân tích (%)
: Hàm lượng hemicellulose trong mẫu phân tích (%)
(*Nguồn: Van Soest và Robertson, 1979)
c)Hàm lƣợng lignin ADL (Acid Detergent Lignin)
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hòa tan cellulose bằng dung dịch H2SO4 72%. Thành phần mẫu còn lại sau khi x lý là lignin thô (Van Soest và Robetson, 1979).
Tiến hành
Đun sôi hoàn lưu 1g mẫu b mía (sản phẩm của quá trình x lý với dung dịch acid) bằng dung dịch H2SO4 72% trong ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. R a 3 lần với nước nóng và 2 lần với acetone. Sấy mẫu thu được ở 70o
C cho tới khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích.
Hàm lƣợng ligin (ADL) đƣợc tính theo công thức X = m1*100/m (%)
Trong đó
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g) m1: Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g)
: Phần trăm ADL trong mẫu phân tích (%)
(*Nguồn: Van Soest và Robertson, 1979)
Hàm lƣợng cellulose
Nguyên tắc: dựa trên sự chênh lệch của chỉ số ADF và ADL (Van Soest và Robertson, 1979).
Hàm lƣợng cellulose đƣợc tính theo công thức X1 = X2 – X (%)
Trong đó
: Phần trăm ADL trong mẫu phân tích (%) X1: Phần trăm cellulose trong mẫu phân tích (%) X2: Phần trăm ADF trong mẫu phân tích (%)
(*Nguồn: Van Soest và Robertson, 1979)
d) Hàm lƣợng xơ thô (CF)
Nguyên tắc: định lượng chất xơ thô dựa vào khả năng hòa tan những hợp chất không phải cellulose (non-cellulose) bằng dung dịch acid sulfuric và bazo. Acid sulfuric phân giải các chất hòa tan trong acid như cacbohydrat thành đường đơn và một phần protein hòa tan. Bazơ phân giải chất béo và hòa tan toàn bộ protein.
Tiến hành:
Cân 2g bột b mía lần lượt được đun hoàn lưu với H2SO4 1,25% (30 phút) và NaOH 1,25% (30 phút). R a mẫu bằng nước kh ion nóng và aceton.
Hàm lượng xơ thô được tính theo công thức sau:
X = m1/m0 *100
Trong đó:
: Phần trăm xơ thô có trong mẫu (% m/m) m1: Trọng lượng mẫu sau khi phân tích (g) m0: Trọng lượng mẫu ban đầu (g)
(*Nguồn: Weenden, 1983)
f) Hàm lƣợng tro tổng (Ash)
Nguyên tắc: Dùng nhiệt đốt cháy hoàn toàn các chất hữu cơ có trong nguyên liệu ở nhiệt độ cao 600oC trong thời gian 3 giờ. Những thành phần còn lại được dùng để xác định phần trăm tro có trong nguyên liệu.
Tiến hành: Nung 2 gram b mía ở 600oC trong 3 giờ, làm nguội mẫu trong bình hút ẩm về nhiệt độ thấp hơn (70oC). Hàm lượng tro tổng được tính theo công thức:
X = m1*100/m (%)
Trong đó:
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g)
m1: Trọng lượng mẫu sau khi tro hóa (g)
3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng phối hợp của nhóm vi khuẩn trong quá trình phân giải bã mía trình phân giải bã mía
Mục đích thí nghiệm: đánh giá và chọn lọc tổ hợp vi khuẩn phân giải b mía tốt nhất.
Mẫu vi khuẩn:
- Ba dòng vi khuẩn dạ c bò: BM13 (Achromobacter xylosoxidans BL6); BM21 (Bacillus subtilis S20) và BM49 (Bacillus subtilis FS321)
- Hai dòng vi khuẩn dạ c trâu: TM9, TM11 (Achromobacter xylosoxidans). - Hai dòng vi khuẩn dạ c cừu: CD11 và CD43.
- Hai dòng vi khuẩn dạ c dê: DD9 (Bacillus subtilis RC24) và DD7 (Bacillus subtilis BA3_1A).
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần l p lại, 11 nghiệm thức. Tổng đơn vị thí nghiệm là 33. Trong đó, NT1 là đối chứng, không chủng vi khuẩn. Các nghiệm thức được bố trí theo bảng 7.
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị vi khuẩn: mỗi dòng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường M2 ở 38oC cho đ n khi đạt mật số 107
CFU/ml dựa vào đường tăng trưởng của các loại vi khuẩn (Nguy n Thanh Son, 2013).
Chủng 6% (v/v) dịch vi khuẩn có mật số 107 CFU/ml (mỗi loại vi khuẩn trong 1 nhóm được pha trộn theo tỉ lệ bằng nhau) vào môi trường M3 có 1g bã mía.
Bảng 7: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 1
* Ghi chú: NT: Nghiệm thức; DC: đối chúng (1): Tổ hợp nhóm vi khuẩn dạ cỏ bò; (2): Tổ hợp nhóm vi khuẩn dạ cỏ trâu; (3): Tổ hợp nhóm vi khuẩn dạ cỏ cừu; (4): tổ hợp nhóm vi khuẩn dạ cỏ dê
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hàm lượng vật chất khô (DM) + Hàm lượng xơ thô (CF)
+ Đường kh sinh ra
3.2.3. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện nhiệt độ lên sự phân giải bã mía:
Mục đích thí nghiệm: xác định nhiệt độ thích hợp để vi khuẩn phân giải b mía mạnh nhất. NT 1 (% v/v) 2 (% v/v) 3 (% v/v) 4 (% v/v) 1 = DC - - - - 2 6 - - - 3 1,5 4,5 - - 4 1,5 - 4,5 - 5 1,5 - - 4,5 6 3 3 - - 7 3 - 3 - 8 3 - - 3 9 4,5 1,5 - - 10 4,5 - 1,5 - 11 4,5 - - 1,5
Bố trí thí nghiệm: 7 nghiệm thức lần lượt là các mức độ: 22oC,30oC, 38oC, 40oC, 45oC, 50 oC và 60 oC. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố, 3 lần l p lại, mỗi mẫu đối chứng ở từng nghiệm thức không chủng vi khuẩn.
Mẫu vi khuẩn: Tổ hợp vi khuẩn đ được tuyển chọn trong thí nghiệm 1 (TN1).
Tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị vi khuẩn: mỗi dòng vi khuẩn của tổ hợp được chọn trong TN1 được nuôi cấy trong môi trường M2 ở 38oC cho đ n khi đạt mật số 107
CFU/ml dựa vào đường tăng trưởng của các loại vi khuẩn trên (Nguy n Thanh Son, 2013).
Chủng 6% (v/v) dịch vi khuẩn có mật số 107
CFU/ml (mỗi loại vi khuẩn trong 1 nhóm được pha trộn theo tỉ lệ bằng nhau) vào môi trường M3 có 1g bã mía.
Ủ trong 5 ngày ở các mức nhiệt độ trên dưới điều kiện kỵ khí.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hàm lượng vật chất khô (DM) + Hàm lượng xơ thô (CF)
+ Đường kh sinh ra
3.2.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện pH lên sự phân giải bã mía
Mục đích thí nghiệm: xác định pH thích hợp để vi khuẩn phân giải b mía mạnh nhất.
Bố trí thí nghiệm: 6 nghiệm thức lần lượt là các mức pH 4; 5; 5,5; 6; 7 và 8. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố, 3 lần l p lại, mỗi mẫu đối chứng ở từng nghiệm thức không chủng vi khuẩn.
Mẫu vi khuẩn: Tổ hợp vi khuẩn đ được tuyển chọn trong thí nghiệm 1.
Tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị vi khuẩn: mỗi dòng vi khuẩn của tổ hợp được chọn trong TN1 được nuôi cấy trong môi trường M2 ở nhiệt độ được chọn cho đ n khi đạt mật số 107 CFU/ml dựa vào đường tăng trưởng của các loại vi khuẩn trên (Nguy n Thanh Son, 2013).
Chủng 6% (v/v) dịch vi khuẩn có mật số 107
CFU/ml (mỗi loại vi khuẩn trong 1 nhóm được pha trộn theo tỉ lệ bằng nhau) vào môi trường M3 có 1g bã mía.
Ủ trong 5 ngày ở nhiệt độ được chọn từ thí nghiệm 2 dưới điều kiện kỵ khí.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hàm lượng vật chất khô (DM) + Hàm lượng xơ thô (CF)
+ Đường kh sinh ra
3.2.5. Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hƣởng của thời gian ủ lên sự phân giải bã mía Mục đích thí nghiệm: xác định thời gian ủ thích hợp để vi khuẩn phân giải bã mía mạnh nhất.
Bố trí thí nghiệm: 10 nghiệm thức được bố trí lần lượt là: 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, 6 ngày, 7 ngày, 8 ngày, 9 ngày, 10 ngày. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố, 10 nghiệm thức với 3 lần l p lại, mỗi mẫu đối chứng ở từng nghiệm thức không chủng vi khuẩn.
Mẫu vi khuẩn: Tổ hợp vi khuẩn đ được tuyển chọn trong TN1.
Tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị vi khuẩn: mỗi dòng vi khuẩn của tổ hợp được chọn trong TN1 được nuôi cấy trong môi trường M2 ở nhiệt độ được chọn trong TN2, pH được chọn trong TN3, cho đ n khi đạt mật số 107 CFU/ml dựa vào đường tăng trưởng của các loại vi khuẩn trên (Nguy n Thanh Son, 2013).
Chủng 6% (v/v) dịch vi khuẩn có mật số 107
CFU/ml (mỗi loại vi khuẩn trong 1 nhóm được pha trộn theo tỉ lệ bằng nhau) vào môi trường M3 có 1g bã mía.
Ủ trong 5 ngày ở nhiệt độ được chọn trong TN2, pH được chọn trong TN3, dưới điều kiện kỵ khí.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hàm lượng vật chất khô (DM) + Hàm lượng xơ thô (CF)
+ Đường kh sinh ra
3.2.6. Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của các nguồn đạm của các loại muối khác nhau trong môi trƣờng lên sự phân giải bã mía
Mục đích: Tìm được loại muối thích hợp cho vào môi trường lên sự phân giải b mía của vi khuẩn.
Bố trí thí nghiệm: 6 nghiệm thức được bố trí lần lượt là 6 loại muối khác nhau, hàm lượng nitơ trong từng loại muối được cố định ở 0,21g. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân tố, 6 nghiệm thức với 3 lần l p lại, mỗi mẫu đối chứng ở từng nghiệm thức không chủng vi khuẩn.
Hàm lượng muối trong thí nghiệm thể hiện ở bảng sau:
Bảng 8: Bảng bố trí thay đổi các loại muối
Loại muối Phân tử lƣợng (g) Hàm lƣợng nitơ (g) Nồng độ (g/l)
(NH4)2SO4 132,1 0,21 1,0 NH4Cl 53,56 0,21 0,81 NaNO3 84,99 0,21 1,28 NH4NO3 80,04 0,21 0,6 KNO3 101,1 0,21 1,53 NH4H2PO4 115,02 0,21 1,74 Tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị vi khuẩn: mỗi dòng vi khuẩn của tổ hợp được chọn trong TN1 được nuôi cấy trong môi trường M2 ở nhiệt độ được chọn trong TN2, pH được chọn trong TN3, thời gian được chọn từ TN4, cho đ n khi đạt mật số 107 CFU/ml dựa vào đường tăng trưởng của các loại vi khuẩn trên (Nguy n Thanh Son, 2013).
Chủng 6% (v/v) dịch vi khuẩn có mật số 107 CFU/ml (mỗi loại vi khuẩn trong 1 nhóm được pha trộn theo tỉ lệ bằng nhau) vào môi trường M3 lần lượt với 6 loại muối khác nhau có 1g bã mía.
Ủ ở nhiệt độ được chọn trong TN2, pH được chọn trong TN3, thời gian được chọn từ TN4 dưới điều kiện kỵ khí.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hàm lượng vật chất khô (DM)
+ Hàm lượng hàm lượng hemicellulose, cellulose và lignin dựa vào các chỉ số ADF, NDF, ADL
+ Đường kh sinh ra
Số liệu được x lý bằng bảng tính Microsoft Excel 2007 và phân tích thống kê trên phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0.
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát thành phần nguyên liệu
Bảng 9: Hàm lƣợng các thành phần khảo sát trong bã mía nguyên liệu Hàm lƣợng vật chất khô (%) Hàm lƣợng Cellulose (%) Hàm lƣợng Hemicellulose (%) Hàm lƣợng Lignin (%) Hàm lƣợng xơ thô (%) Hàm lƣợng tro (%) 90,94 56,13 18,56 18,80 95,67 1,52 4.1.1. Hàm lƣợng vật chất khô
Bột b mía sau khi được rữa bằng nước lọc để loại b đường được sấy ở 70o C trong 3 ngày đ n khô và trữ vào túi nylong để s d ng làm cơ chất cho thí nghiệm.
Hàm lượng vật chất khô sau khi sấy đ n trọng lượng không đổi của b mía nguyên liệu đạt 90,94%. Có nghĩa là trong 100g mẫu có 90,94g vật chât khô không nước. K t quả này cao hơn với k t quả của Đào Lệ Hằng (2008) với 85,49% vật chất khô. Tuy nhiên, trên cùng nguyên liệu b mía k t quả nghiên cứu khi phân tích hàm lượng vật chất khô của Ilindra và Dhake (2008) và của Glauber et al. (2013) lần lượt là 93,3% và 94,8% đều cao hơn k t quả nghiên cứu này. Với 90,94% vật chất khô thấp hơn khảo sát của Đỗ Thị Cẩm Hường (2012) với hàm lượng vật chất khô ở bột b mía là 93,69%. Do b mía trong các nghiên cứu được x lý và bảo quản khác nhau nên hàm lượng vật chất khô không giống nhau. Độ ẩm trong không khí, nhiệt độ môi trường xung quanh rất ảnh hưởng đ n hàm lượng vật chất khô.
4.1.2. Hàm lƣợng cellulose
Trong b mía có khoảng 40 - 50% cellulose theo k t quả nghiên cứu của Dekker và Wallis (1983). Hàm lượng cellulose trong b mía nguyên liệu đạt 56,13%. K t quả này so với các nghiên cứu của Camila et al. (2011) (35,2%) và của Hamissa et al. (1985) (48,1%) đều cao hơn rất nhiều. K t quả này cũng cao hơn k t quả của Chu Thị Thơm et al. 2006, với hàm lượng cellulose là 46%. Tuy nhiên, 56,13% thấp hơn khảo sát của Anusith et al. (2011) với 58,23%và Glauber et al. (2013) với 64,5%. Bên cạnh đó, hàm lượng cellulose này tương đương với khảo sát của Issay (1980) với lượng chất cellulose trong xơ mía là 56,5%. Có nhiều y u tố ảnh hưởng đ n lượng cellulose trong bã mía. Trong đó, nguồn b mía thu được từ nhiều nguồn khác nhau trong những thời
gian khác nhau dẫn đ n khác biệt trong khảo sát của những nghiên cứu nêu trên. M t khác có thể là do b mía được s d ng trong thí nghiệm đ được x lý loại đường qua nhiều lần r a bằng nước lọc, vì vậy nhiều thành phần khoáng, chất hòa tan khác có trong bột b mía đ được loại b , nên tỷ lệ xơ còn lại sau khi phân tích chi m rất cao so với các k t quả của những nghiên cứu trước của Hamissa et al. (1985) và Sallam et al. (2007).
4.1.3. Hàm lƣợng hemicellulose
Hàm lượng hemicellulose thu được đạt 18,56% cao hơn hàm lượng hemicellulose thu được trong nghiên cứu của Akinfemi (2012) là 15,98%. K t quả này ít khác biệt với k t quả của Nguy n Thanh Son (2013) với 18,05%. Ngược lại, k t quả này thấp hơn hàm lượng hemicellulose thu được 24,50% của Camilaet al. (2011), Anusith et al. (2011) (25,42%), Sun et al. (2002) (24%), và Sallam et al. (2007) là 29,4%. Các loại giống mía khác nhau và cách x lý không giống nhau dẫn đ n có sự khác biệt hàm lượng hemicelluloses giữa các nghiên cứu.
4.1.4. Hàm lƣợng lignin
Cơ chất có tỉ lệ lignin càng cao thì vi khuẩn càng khó phân giải do cấu trúc bền vững nhất của nó, lignin giúp ngăn cản sự xâm nhập của enzyme cellulase của vi khuẩn. Dựa vào chỉ số ADL thì hàm lượng lignin được xác định là 18,80%. K t quả lignin trong khảo sát cao hơn so với Trần Hồ Di m Đoan (2013) (14,63%), Anusith et al. (2011) (14,95%), và Gado (1999) (10,4%). Nhưng các nghiên cứu của Ilindra và Dhake (2008), Camila et al. (2011) và Dekker và Wallis (1983) với hàm lượng lignin lần lượt là 21,1%, 22,2% và 24% đều cao hơn hàm lượng lignin trong khảo sát này.
So với các nguyên liệu khác như: thân ngô, v trấu, c khô,… thì hàm lượng lignin trong b mía là 18,8% đều cao hơn nhiều. Theo Nguy n Thị Xuân Hà, hàm lượng lignin trên thân ngô là 11,2%. Hàm lượng lignin cao so với v trấu là 12,75%,