2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Nguy n Đức Lượng và Nguy n Phượng Hải (1996) nghiên cứu thành công việc tuyển chọn vi sinh vật tổng hợp enzyme cellulase để x lý cellulose.
Phân lập các chủng vi sinh vật phân giải cellulose từ đất, bùn mía. Các chủng nấm phân lập trên môi trường Czapek-Dox có bổ sung bột giấy, các chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường Lemberk và Colmer với một dải giấy lọc. Phương pháp xác đinh hoạt tính cellulase ngoại bào bằng kh ch tán trên thạch. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase theo Nelson-Somogyi đ phân lập được 6 chủng nấm và 15 chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase. Nguồn cơ chất có ảnh hưởng rõ rệt lên hoạt tính CMCase của các chủng nấm nghiên cứu (Nguy n Thị Kim Cúc, 2001).
Hai chủng xạ khuẩn và hai chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, được phân lập từ rơm rạ. Các dòng vi sinh vật được dùng làm ch phẩm vi sinh để x lý ph
thải nông nghiệp làm phân bón cho cây trồng, ph c v nền sản xuất nông nghiệp sạch (Trần Thị Hồng, 2008).
Võ Hoài Bắc et al. (2010) đ phân lập được 17 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải mạnh cơ chất cellulose, trong đó chọn và định danh hai dòng có khả năng phân giải mạnh nhất là Bacillus licheniformis (Li) và Bacillus subtilis VTCC-B-505.
Võ Văn Phước Quệ et al. (2011) đ phân lập được bốn dòng vi khuẩn (Q4, Q5, Q7 và Q8) từ mẫu đất trồng lúa và dạ c bò, có khả năng phân giải cellulose trên cơ chất rơm rạ và giấy mạnh nhất. Trong đó, có ba dòng Q5, Q7 và Q8 đồng hình 99% với dòng Bacillus megaterium, dòng vi khuẩn Q4 đồng hình 99% với dòng
Cellulomonas flavigena.
Đ phân lập và tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn phân giải cellulose chịu nhiệt, 3 chủng xạ khuẩn ưa nấm, 2 chủng nấm mốc. Chọn hỗn hợp các chủng vi sinh vật này làm ch phẩm phân giải ph thải và ph phẩm mía đường, đạt hiệu quả cao (nhiệt độ ủ đống bùn mía cao 70oC, lượng cellulose được tiêu hao so với ban đầu là >23%). Qua đó nhằm nâng cao chất lượng phân phức hợp hữu cơ vi sinh, góp phần cải tạo đất, tăng thêm danh thu và phát triển bền vững các chương trình mía đường quốc gia (Lê Thị Việt Hà, 2006).
Nguy n Vũ Hoàng Sơn et al. (2010) đ chọn được 2 dòng vi khuẩn kỵ khí (dòng 43 và 44) có hoạt tính phân giải mạnh trên cơ chất m n dừa. Đồng thời, khảo sát được điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase trên cơ chất m n dừa của 2 dòng vi khuẩn lần lượt là 1g/l (NH4)2SO4, pH 6, nhiệt độ 35o
C và 1,15g/l (NH4)2SO4, pH 9, nhiệt độ 35oC. Thời gian thích hợp cho cả 2 dòng vi khuẩn này phân giải m n dừa cao là 48 giờ trong môi trường bán rắn với cơ chất m n dừa đ loại b tanin, hiệu suất phân giải cơ chất m n dừa là 18%.
2.6.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Có 3 dòng vi khuẩn cellulase chịu nhiệt được phân lập từ mẫu đất và nước ở suối nước nóng của Ai Cập. Phân tích di truyền phân t trên trình tự 16S rRNA cho thấy dòng vi khuẩn EFP1 đồng hình 98,5% với dòng Anoxybacillus flavithermus, dòng vi khuẩn EFP2 đồng hình 98,5% với Geobacillus thermodenitrificans. Hoạt tính phân giải của vi khuẩn trên CMC cao hơn các hợp chất nghiên cứu (avicell, cellobiose và xylan) (Abdelnasser và Ahmed, 2007).
Clostridium papyrosolvens cũng được phát hiện có khả năng tổng hợp cellulase và được nuôi cấy 48 giờ ở 35OC trong điều kiện kỵ khí cho hoạt tính CMCase cao. CMCase có nhiệt độ tối ưu là 35OC và pH tối ưu là 6,5 đ n 7,5 (Rani et al., 2004).
Zora et al. (2000) đ nghiên cứu sự lên men xơ của vi sinh vật đường ruột già và cho nhận định là sự lên men đó tương tự như ở dạ c . Tuy nhiên, hiệu quả lên men kém hơn ở dạ c vì thi u sự hiện diện của nấm và protozoa (Zora et al., 2000; López et al., 2000; Omed et al., 2000).
Abou-Taleb et al. (2009), khảo sát một số y u tố ảnh hưởng đ n sản xuất cellulase của 2 dòng vi khuẩn Bacillus alcalophilus S39 và Bacillus amyloliquefaciens
C23 phân giải cellulose. ác định được rằng 1% CMC và 0.7% yeast là hàm lượng cung cấp carbon, nitơ và 3% vi khuẩn chủng vào ở điều kiện pH 7 là thích hợp nhất đê sản xuất cellulase của 2 dòng vi khuẩn này.
Oyeleke và Okusanmi (2008), đ ti n hành phân lập và khảo sát hoạt tính phân giải cellulose của vi sinh vật từ dạ c động vật nhai lại như bò, cừu và dê. K t quả phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose như P. eruginosa, Streptococcus, Bacillus, Penicillin, Aspergillus, Mucor và Fusarium.
Barbara et al. (1969), phân lập được 30 dòng vi khuẩn từ dạ c cừu. Trong đó có 19 dòng phẩy khuẩn gam âm thuộc chi Butyrivibro, bốn dong cầu khuẩn thuộc nhóm
Ruminococcus albus, năm dòng cầu khuẩn thuộc nhóm R. flavefacien, 2 dòng còn lại được xác định thuộc chi Clostridium.
Ba dòng vi khuẩn Fibrobacter succinogenes, ruminococcus flavefacien và
ruminococcus albus được Hungate (1996) phân lập từ dạ c động vật nhai lại có khả năng tiêu hóa cellulose cao. Theo nghiên cứu của Findlay (1998) các dòng vi khuẩn
Fbrobacter succinogenes, Bacteroides succinogenes, Ruminococcus albus, Rumonococcus flavefacien, Clostridium ochheadii, Bacillus licheniformis và
Streptococcus anaerobius có khả năng phân giải cellulose mạnh trong dạ c động vật nhai lại.
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, địa điểm
Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật , tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), quang phổ k , nồi kh trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa K ), pH k Orion 420A (Hoa K ), cân điện t Satorius (Đức), lò vi sóng Panasonic (Thái lan), máy ly tâm, tủ lạnh -40C Akira (Việt Nam) và tủ lạnh -4o
C Akira (Việt Nam), máy ch p ảnh kỹ thuật số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu.
Dụng cụ: Eppendorf centrifuge 5417 (Đức), bộ micropipette (Bio-Rad) P10, P20, P200, P1000 (Đức), ống nghiệm, bình tam giác 50 ml, 100 ml, đĩa petri (Đức), ống nghiệm 15 ml (Đức) và một số d ng c khác như: kính lúp, que cấy, que thủy tinh, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, ống đong, đèn cồn,…
Hóa chất: Ethanol 95%, agar, acid sulfuric (H2SO4) đậm đ c, natri clorua (NaCl), K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, n-octanol (C8H18O), acetone, Sodium hidroxide (NaOH), acetate buffer,...
Địa điểm: phòng thí nghiệm Sinh Hóa, PTN Công nghệ Enzyme, PTN Vi Sinh Thực phẩm, PTN Vi sinh vật thuộc Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Hình 5: Một số thiết bị 3.1.2. Nguyên vật liệu
B mía: sau khi thu từ nhà máy đường Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang được sấy ở 70oC trong 30 - 45 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích thước lỗ lưới là 0,2mm. Bột b mía sau khi nghiền được r a với nước lọc nhiều lần để loại đường.
Nguồn vi khuẩn do phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme cung cấp bao gồm: - Ba dòng vi khuẩn dạ c bò: BM13 (Achromobacter xylosoxidans BL6); BM21 (Bacillus subtilis S20) và BM49 (Bacillus subtilis FS321)
- Hai dòng vi khuẩn dạ c trâu: TM9, TM11 (Achromobacter xylosoxidans).
- Hai dòng vi khuẩn dạ c cừu: CD11 (Achromobacter piechaudii M52) và CD43 (Bacillus tequilensis TXJB 020)
- Hai dòng vi khuẩn dạ c dê: DD9 (Bacillus subtilis RC24) và DD7 (Bacillus subtilis BA3_1A).
3.1.3. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật
Bảng 4: Thành phần môi trƣờng rắn cải tiến (M1)
Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể
tích Đơn vị Bột b mía (NH4)2SO4 KH2PO4 K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl Agar Nước 10 1 1 1 0,5 0,001 20 1000 gram gram gram gram gram gram gram ml
(* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh, 2010)
Môi trƣờng lỏng Ryckeboer ( 2003) cải tiến
Bảng 5: Thành phần môi trƣờng lỏng cải tiến (M2) Tên hóa chất Khối lƣợng/ Thể tích Đơn vị
Bột b mía (NH4)2SO4 KH2PO4 K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl Nước 10 1 1 1 0,5 0,001 1000 gram gram gram gram gram gram ml
Môi trƣờng khoáng Ryckeboer (2003):
Bảng 6: Thành phần môi trƣờng khoáng Ryckeboer (2003) (M3) Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể tích Đơn vị
(NH4)2SO4 1 Gram
K2HPO4 1 Gram
MgSO4.7H2O 0,5 Gram
NaCl 0,001 Gram
Nước 1000 Ml
(* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh., 2010)
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 3.2.1. Khảo sát nguyên liệu 3.2.1. Khảo sát nguyên liệu
Mục đích: Đánh giá nguyên liệu trước khi thực hiện thí nghiệm để so sánh với k t quả sau khi dùng vi khuẩn phân giải.
Mẫu: Bã mía.
Các chỉ tiêu khảo sát: Hàm lượng vật chất khô, tro, hàm lượng xơ thô, hàm lượng hemicellulose, hàm lượng cellulose và hàm lượng lignin.
a) Hàm lƣợng vật chất khô (DM)
Nguyên tắc: Dùng nhiệt làm bay hơi nước có trong nguyên liệu. Phần còn lại là vật chất khô của nguyên liệu (AOAC, 1993).
Tiến hành
Sấy 2g b mía ở 70o
C cho tới khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích.
Hàm lượng vật chất khô được tính theo công thức:
X = m1*100/m (%)
Trong đó
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g) m1: Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g)
(*Nguồn: AOAC, 1993)
b) Hàm lƣợng hemicellulose (Neutral Detergent Fiber-NDF, Acid Detergent Fiber-ADF)
Nguyên tắc: dựa trên sự chênh lệch giữa 2 chỉ số NDF và ADF (Reed và Van Soest, 1985).
Tiến hành
Hàm lƣợng NDF (Neutral Detergent Fiber)
1g b mía được x lý hoàn lưu với dung dịch trung tính NDF, n-octanol và Na2SO3 với nhiệt trong 60 phút. Sau đó r a 3 lần với nước nóng và 2 lần với acetone. Sấy mẫu thu được ở 70o
C cho tới khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích.
Hàm lượng NDF được tính theo công thức:
X1 = m1*100/m (%)
Trong đó
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g) m1: Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g)
X1: Phần trăm NDF trong mẫu phân tích (%)
(*Nguồn: Van Soest và Wine, 1967)
Hàm lƣợng ADF (Acid Detergent Fiber)
1g b mía được x lý hoàn lưu với dung dịch acid và n-octanol với nhiệt trong 60 phút. R a 3 lần với nước nóng và 2 lần với acetone. Sấy mẫu thu được ở 70oCcho tới khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích.
Hàm lượng ADF được tính theo công thức:
X2 = m2*100/m (%)
Trong đó
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g) m2: Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g)
X2: Phần trăm ADF trong mẫu phân tích (%)
(*Nguồn: Van Soest và Robertson, 1979)
X = X1 – X2 (%)
Trong đó
X1: Phần trăm NDF trong mẫu phân tích (%) X2: Phần trăm ADF trong mẫu phân tích (%)
: Hàm lượng hemicellulose trong mẫu phân tích (%)
(*Nguồn: Van Soest và Robertson, 1979)
c)Hàm lƣợng lignin ADL (Acid Detergent Lignin)
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hòa tan cellulose bằng dung dịch H2SO4 72%. Thành phần mẫu còn lại sau khi x lý là lignin thô (Van Soest và Robetson, 1979).
Tiến hành
Đun sôi hoàn lưu 1g mẫu b mía (sản phẩm của quá trình x lý với dung dịch acid) bằng dung dịch H2SO4 72% trong ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. R a 3 lần với nước nóng và 2 lần với acetone. Sấy mẫu thu được ở 70o
C cho tới khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích.
Hàm lƣợng ligin (ADL) đƣợc tính theo công thức X = m1*100/m (%)
Trong đó
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g) m1: Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g)
: Phần trăm ADL trong mẫu phân tích (%)
(*Nguồn: Van Soest và Robertson, 1979)
Hàm lƣợng cellulose
Nguyên tắc: dựa trên sự chênh lệch của chỉ số ADF và ADL (Van Soest và Robertson, 1979).
Hàm lƣợng cellulose đƣợc tính theo công thức X1 = X2 – X (%)
Trong đó
: Phần trăm ADL trong mẫu phân tích (%) X1: Phần trăm cellulose trong mẫu phân tích (%) X2: Phần trăm ADF trong mẫu phân tích (%)
(*Nguồn: Van Soest và Robertson, 1979)
d) Hàm lƣợng xơ thô (CF)
Nguyên tắc: định lượng chất xơ thô dựa vào khả năng hòa tan những hợp chất không phải cellulose (non-cellulose) bằng dung dịch acid sulfuric và bazo. Acid sulfuric phân giải các chất hòa tan trong acid như cacbohydrat thành đường đơn và một phần protein hòa tan. Bazơ phân giải chất béo và hòa tan toàn bộ protein.
Tiến hành:
Cân 2g bột b mía lần lượt được đun hoàn lưu với H2SO4 1,25% (30 phút) và NaOH 1,25% (30 phút). R a mẫu bằng nước kh ion nóng và aceton.
Hàm lượng xơ thô được tính theo công thức sau:
X = m1/m0 *100
Trong đó:
: Phần trăm xơ thô có trong mẫu (% m/m) m1: Trọng lượng mẫu sau khi phân tích (g) m0: Trọng lượng mẫu ban đầu (g)
(*Nguồn: Weenden, 1983)
f) Hàm lƣợng tro tổng (Ash)
Nguyên tắc: Dùng nhiệt đốt cháy hoàn toàn các chất hữu cơ có trong nguyên liệu ở nhiệt độ cao 600oC trong thời gian 3 giờ. Những thành phần còn lại được dùng để xác định phần trăm tro có trong nguyên liệu.
Tiến hành: Nung 2 gram b mía ở 600oC trong 3 giờ, làm nguội mẫu trong bình hút ẩm về nhiệt độ thấp hơn (70oC). Hàm lượng tro tổng được tính theo công thức:
X = m1*100/m (%)
Trong đó:
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g)
m1: Trọng lượng mẫu sau khi tro hóa (g)
3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng phối hợp của nhóm vi khuẩn trong quá trình phân giải bã mía trình phân giải bã mía
Mục đích thí nghiệm: đánh giá và chọn lọc tổ hợp vi khuẩn phân giải b mía tốt nhất.
Mẫu vi khuẩn:
- Ba dòng vi khuẩn dạ c bò: BM13 (Achromobacter xylosoxidans BL6); BM21 (Bacillus subtilis S20) và BM49 (Bacillus subtilis FS321)
- Hai dòng vi khuẩn dạ c trâu: TM9, TM11 (Achromobacter xylosoxidans). - Hai dòng vi khuẩn dạ c cừu: CD11 và CD43.
- Hai dòng vi khuẩn dạ c dê: DD9 (Bacillus subtilis RC24) và DD7 (Bacillus subtilis BA3_1A).
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần l p lại, 11 nghiệm thức. Tổng đơn vị thí nghiệm là 33. Trong đó, NT1 là đối chứng, không chủng vi khuẩn. Các nghiệm thức được bố trí theo bảng 7.
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị vi khuẩn: mỗi dòng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường M2 ở 38oC cho đ n khi đạt mật số 107
CFU/ml dựa vào đường tăng trưởng của các loại vi khuẩn (Nguy n Thanh Son, 2013).
Chủng 6% (v/v) dịch vi khuẩn có mật số 107 CFU/ml (mỗi loại vi khuẩn trong 1 nhóm được pha trộn theo tỉ lệ bằng nhau) vào môi trường M3 có 1g bã mía.
Bảng 7: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 1
* Ghi chú: NT: Nghiệm thức; DC: đối chúng (1): Tổ hợp nhóm vi khuẩn dạ cỏ bò; (2): Tổ hợp nhóm vi khuẩn dạ cỏ trâu; (3): Tổ hợp nhóm vi khuẩn dạ cỏ cừu; (4): tổ hợp nhóm vi khuẩn dạ cỏ dê
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hàm lượng vật chất khô (DM) + Hàm lượng xơ thô (CF)
+ Đường kh sinh ra
3.2.3. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện nhiệt độ lên sự phân giải bã mía:
Mục đích thí nghiệm: xác định nhiệt độ thích hợp để vi khuẩn phân giải b mía mạnh nhất. NT 1 (% v/v) 2 (% v/v) 3 (% v/v) 4 (% v/v) 1 = DC - - - - 2 6 - - - 3 1,5 4,5 - - 4 1,5 - 4,5 - 5 1,5 - - 4,5 6 3 3 - - 7 3 - 3 - 8 3 - - 3 9 4,5 1,5 - - 10 4,5 - 1,5 - 11 4,5 - - 1,5
Bố trí thí nghiệm: 7 nghiệm thức lần lượt là các mức độ: 22oC,30oC, 38oC, 40oC, 45oC, 50 oC và 60 oC. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố, 3 lần l p lại, mỗi mẫu đối chứng ở từng nghiệm thức không chủng vi khuẩn.
Mẫu vi khuẩn: Tổ hợp vi khuẩn đ được tuyển chọn trong thí nghiệm 1 (TN1).
Tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị vi khuẩn: mỗi dòng vi khuẩn của tổ hợp được chọn trong TN1 được nuôi cấy trong môi trường M2 ở 38oC cho đ n khi đạt mật số 107
CFU/ml dựa vào đường tăng trưởng của các loại vi khuẩn trên (Nguy n Thanh Son, 2013).
Chủng 6% (v/v) dịch vi khuẩn có mật số 107
CFU/ml (mỗi loại vi khuẩn trong 1 nhóm được pha trộn theo tỉ lệ bằng nhau) vào môi trường M3 có 1g bã mía.
Ủ trong 5 ngày ở các mức nhiệt độ trên dưới điều kiện kỵ khí.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hàm lượng vật chất khô (DM) + Hàm lượng xơ thô (CF)
+ Đường kh sinh ra
3.2.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện pH lên sự phân giải bã mía
Mục đích thí nghiệm: xác định pH thích hợp để vi khuẩn phân giải b mía mạnh nhất.
Bố trí thí nghiệm: 6 nghiệm thức lần lượt là các mức pH 4; 5; 5,5; 6; 7 và 8. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố, 3 lần l p lại, mỗi mẫu đối chứng ở từng nghiệm thức không chủng vi khuẩn.