Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh; các loài ưa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện dưới 15oC, khoảng nhiệt độ 20 - 40o
C để thích nghi tốt cho các loài ưa ấm; còn các loài chịu nhiệt phát triển tốt ở nhiệ t độ cao trên 50oC.
Nghiên cứu của Nguy n Lan Hương và Hoàng Đình Hòa (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50oC. Dòng vi khuẩn Bacillus subtillis có khả năng sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở nhiệt độ 40oC (Mohamed et al., 2010). Khi nghiên cứu các vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45 - 55oC và có thể chịu được nhiệt độ 65 - 80oC (Tăng Thị Chính et al., 1999). Trong khi đó, Bakare et al. (2005) trình bày nhiệt độ tối ưu cho sự sinh tổng hợp cellulase của dòng Pseudomonas fluorescence trong khoảng 30 - 35oC. Theo Tang et al. (2004) khi nghiên cứu các chủng vi sinh vật endo-β-1,4-glucanase cho thấy, ở chủng vi khuẩn B. subtilis nhiệt độ thích hợp cho tổng hợp enzyme là 37oC.
2.4.4. pH môi trƣờng
Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trường ban đầu là 6; còn dòng vi khuẩn họ Cellumonas,
cho dòng vi khuẩn Chaetomium crispatum sinh tổng hợp cellulase (Herman và Vandamme, 1983).
Ngoài những y u tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các loài enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều y u tố khác như: thời gian nuôi cấy, chỉ số CO2 trong nuôi cấy, mật số vi sinh vật được chủng vào ban đầu,…
2.5. Một số phƣơng pháp nghiên cứu. 2.5.1. Vật chất khô (DM) của bã mía 2.5.1. Vật chất khô (DM) của bã mía
Nguyên tắc: Dùng nhiệt làm bay hơi nước có trong nguyên liệu. Cân trọng lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy khô ở 70o
C bằng cân phân tích. Phần còn lại là vật chất khô của nguyên liệu (AOAC, 1993).
2.5.2. Phƣơng pháp phân tích xơ
Phân tích thành phần chất xơ trước và sau khi phân giải có vai trò quan trọng trong đánh giá chất lượng tỉ lệ tiêu hóa ở gia súc nhai lại, nó giúp chúng ta hiểu rõ hơn về các y u tố ảnh hưởng đ n tỉ lệ tiêu hóa và năng suất vật nuôi. Hệ thống tẩy xác định NDF ngày càng được s d ng rộng r i trong các phòng thí nghiệm vì nó nêu được thành phần hemicellulose, cellulose, và lignin. Thành phần cầu nối lignin-cellulose được thể hiện ở giá trị ADF và ADL trong hệ thống phân tích xơ thức ăn của Van Soest và Robertson (1979).
Các thành phần ADF, NDF, ADL có vai trò quan trọng để xác định giá trị dinh dưỡng. Chúng có thể s d ng để dự đoán tỉ lệ tiêu hóa, mức tiêu th thức ăn của gia súc nhai lại, giá trị năng lượng trao đổi của thức ăn gia súc nhai lại (Van Soest và Robertson, 1979).
a) Phƣơng pháp phân tích xơ trung tính (NDF)
Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào sự hòa tan hóa các nguồn carbon hòa tan, pectin, phần lớn protein, lipids, các khoáng hòa tan, một số silica trong môi trường dung dịch tẩy trung tính. Phần còn lại là những thành phần của t bào thực vật bao gồm: hemicellulose, cellulose, lignin, cutin, khoáng không tan và protein màng. Thành phần dung dịch tẩy trung tính gồm: Na2Br4O7.10H2O, C10H14N2Na2O8, C12H25NaO4S, C4H10O2 và Na2HPO4 (Van Soest và Wine, 1967).
Nguyên tắc: phương pháp xơ acid dựa vào đ c tính không tan trong dung dịch acid của cellulose, lignin, cutin và khoáng không tan trong thực phẩm. Thành phần dung dịch acid gồm C19H42BrN và H2SO4 1N (Van Soest và Robertson, 1979). Hàm lượng hemicellulose trong mẫu được xác định dựa vào sự chênh lệch khối lượng giữa NDF và ADF (Reed và Van Soest, 1985).
c) Phƣơng pháp phân tích lignin (ADL)
Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên sự bền vững của lignin dưới tác d ng của môi trường acid nồng độ cao (H2SO4 72%) (Van Soest và Robertson, 1979).
d) Phƣơng pháp định lƣợng xơ thô (CF)
Nguyên tắc: Phương pháp định lượng xơ thô dựa vào tính chất bền nhiệt của cellulose đối với acid mạnh và bazơ mạnh, cellulose không được phân giải bởi acid y u. Các hợp chất đi kèm với cellulose (hemicelluloses, lignin, tinh bột,…) ít bền hơn đối với tác d ng của acid và kiềm nên được phân giải và tan vào dung dịch khi x lý nguyên liệu (Phạm Thị Ánh Hồng, 2003).
2.5.3. Khảo sát nồng độ đƣờng khử sinh ra bằng phƣơng pháp Nelson
Phương pháp Nelson (1944) dùng để xác định hoạt tính enzyme dựa vào lượng đường kh sinh ra thông qua phản ứng với thuốc th Nelson. Khi enzyme phân giải cơ chất (tinh bột, cellulose,…) tạo glucose, glucose sẽ tác d ng với thuốc th đồng khi đun nóng cho màu đ gạch. Sau đó, khi cho thuốc th Aseno Moblybdate vào sẽ làm dung dịch chuyển sang màu xanh da trời và hấp th ánh sáng ở bước sóng 520 nm.
a) Xây dựng đƣờng chuẩn:
Chuẩn bị 6 eppendorf với thành phần hoá chất như bảng 2
Bảng 2: Thành phần hóa học của dung dịch stock
[Glucose] (nM) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
VGlucose (1mM) (mL) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
V H2O(mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
Bảng 3: Bố trí thí nghi ệm đo đƣờng khử bằng phƣơng pháp Nelson - Soymogi
[Glucose] (mM) 0,0mM 0,2mM 0,4mM 0,6mM 0,8mM 1,0mM
VGlucose 150 µL 150 µL 150 µL 150 µL 150 µL 150 µL (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thuốc thử đồng 150 µL 150 µL 150 µL 150 µL 150 µL 150 µL
Đun sôi 10 phút, để nguội ở nhiệt độ phòng Thuốc thử
Arseno- molybdate
150 µL 150 µL 150 µL 150 µL 150 µL 150 µL
V nƣớc cất 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
Ủ 20 phút. Sau đó, ly tâm để loại bỏ kết tủa. Đo quang phổ OD 520nm
Ghi nhận k t quả và phân tích.
b) Xác định nồng độ đƣờng khử của mẫu dịch thuỷ phân bã mía
Ti n hành các pha hoá chất tương tự như bảng 3. Thay th glucose trong bảng bằng mẫu dịch vi khuẩn.
Đo OD ở 520 nm.
Dựa vào phương trình đường chuẩn, xác định nồng độ đường kh trong mẫu
2.6. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nƣớc 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Nguy n Đức Lượng và Nguy n Phượng Hải (1996) nghiên cứu thành công việc tuyển chọn vi sinh vật tổng hợp enzyme cellulase để x lý cellulose.
Phân lập các chủng vi sinh vật phân giải cellulose từ đất, bùn mía. Các chủng nấm phân lập trên môi trường Czapek-Dox có bổ sung bột giấy, các chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường Lemberk và Colmer với một dải giấy lọc. Phương pháp xác đinh hoạt tính cellulase ngoại bào bằng kh ch tán trên thạch. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase theo Nelson-Somogyi đ phân lập được 6 chủng nấm và 15 chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase. Nguồn cơ chất có ảnh hưởng rõ rệt lên hoạt tính CMCase của các chủng nấm nghiên cứu (Nguy n Thị Kim Cúc, 2001).
Hai chủng xạ khuẩn và hai chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, được phân lập từ rơm rạ. Các dòng vi sinh vật được dùng làm ch phẩm vi sinh để x lý ph
thải nông nghiệp làm phân bón cho cây trồng, ph c v nền sản xuất nông nghiệp sạch (Trần Thị Hồng, 2008).
Võ Hoài Bắc et al. (2010) đ phân lập được 17 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải mạnh cơ chất cellulose, trong đó chọn và định danh hai dòng có khả năng phân giải mạnh nhất là Bacillus licheniformis (Li) và Bacillus subtilis VTCC-B-505.
Võ Văn Phước Quệ et al. (2011) đ phân lập được bốn dòng vi khuẩn (Q4, Q5, Q7 và Q8) từ mẫu đất trồng lúa và dạ c bò, có khả năng phân giải cellulose trên cơ chất rơm rạ và giấy mạnh nhất. Trong đó, có ba dòng Q5, Q7 và Q8 đồng hình 99% với dòng Bacillus megaterium, dòng vi khuẩn Q4 đồng hình 99% với dòng
Cellulomonas flavigena.
Đ phân lập và tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn phân giải cellulose chịu nhiệt, 3 chủng xạ khuẩn ưa nấm, 2 chủng nấm mốc. Chọn hỗn hợp các chủng vi sinh vật này làm ch phẩm phân giải ph thải và ph phẩm mía đường, đạt hiệu quả cao (nhiệt độ ủ đống bùn mía cao 70oC, lượng cellulose được tiêu hao so với ban đầu là >23%). Qua đó nhằm nâng cao chất lượng phân phức hợp hữu cơ vi sinh, góp phần cải tạo đất, tăng thêm danh thu và phát triển bền vững các chương trình mía đường quốc gia (Lê Thị Việt Hà, 2006).
Nguy n Vũ Hoàng Sơn et al. (2010) đ chọn được 2 dòng vi khuẩn kỵ khí (dòng 43 và 44) có hoạt tính phân giải mạnh trên cơ chất m n dừa. Đồng thời, khảo sát được điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase trên cơ chất m n dừa của 2 dòng vi khuẩn lần lượt là 1g/l (NH4)2SO4, pH 6, nhiệt độ 35o
C và 1,15g/l (NH4)2SO4, pH 9, nhiệt độ 35oC. Thời gian thích hợp cho cả 2 dòng vi khuẩn này phân giải m n dừa cao là 48 giờ trong môi trường bán rắn với cơ chất m n dừa đ loại b tanin, hiệu suất phân giải cơ chất m n dừa là 18%.
2.6.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Có 3 dòng vi khuẩn cellulase chịu nhiệt được phân lập từ mẫu đất và nước ở suối nước nóng của Ai Cập. Phân tích di truyền phân t trên trình tự 16S rRNA cho thấy dòng vi khuẩn EFP1 đồng hình 98,5% với dòng Anoxybacillus flavithermus, dòng vi khuẩn EFP2 đồng hình 98,5% với Geobacillus thermodenitrificans. Hoạt tính phân giải của vi khuẩn trên CMC cao hơn các hợp chất nghiên cứu (avicell, cellobiose và xylan) (Abdelnasser và Ahmed, 2007).
Clostridium papyrosolvens cũng được phát hiện có khả năng tổng hợp cellulase và được nuôi cấy 48 giờ ở 35OC trong điều kiện kỵ khí cho hoạt tính CMCase cao. CMCase có nhiệt độ tối ưu là 35OC và pH tối ưu là 6,5 đ n 7,5 (Rani et al., 2004).
Zora et al. (2000) đ nghiên cứu sự lên men xơ của vi sinh vật đường ruột già và cho nhận định là sự lên men đó tương tự như ở dạ c . Tuy nhiên, hiệu quả lên men kém hơn ở dạ c vì thi u sự hiện diện của nấm và protozoa (Zora et al., 2000; López et al., 2000; Omed et al., 2000).
Abou-Taleb et al. (2009), khảo sát một số y u tố ảnh hưởng đ n sản xuất cellulase của 2 dòng vi khuẩn Bacillus alcalophilus S39 và Bacillus amyloliquefaciens
C23 phân giải cellulose. ác định được rằng 1% CMC và 0.7% yeast là hàm lượng cung cấp carbon, nitơ và 3% vi khuẩn chủng vào ở điều kiện pH 7 là thích hợp nhất đê sản xuất cellulase của 2 dòng vi khuẩn này.
Oyeleke và Okusanmi (2008), đ ti n hành phân lập và khảo sát hoạt tính phân giải cellulose của vi sinh vật từ dạ c động vật nhai lại như bò, cừu và dê. K t quả phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose như P. eruginosa, Streptococcus, Bacillus, Penicillin, Aspergillus, Mucor và Fusarium.
Barbara et al. (1969), phân lập được 30 dòng vi khuẩn từ dạ c cừu. Trong đó có 19 dòng phẩy khuẩn gam âm thuộc chi Butyrivibro, bốn dong cầu khuẩn thuộc nhóm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ruminococcus albus, năm dòng cầu khuẩn thuộc nhóm R. flavefacien, 2 dòng còn lại được xác định thuộc chi Clostridium.
Ba dòng vi khuẩn Fibrobacter succinogenes, ruminococcus flavefacien và
ruminococcus albus được Hungate (1996) phân lập từ dạ c động vật nhai lại có khả năng tiêu hóa cellulose cao. Theo nghiên cứu của Findlay (1998) các dòng vi khuẩn
Fbrobacter succinogenes, Bacteroides succinogenes, Ruminococcus albus, Rumonococcus flavefacien, Clostridium ochheadii, Bacillus licheniformis và
Streptococcus anaerobius có khả năng phân giải cellulose mạnh trong dạ c động vật nhai lại.
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, địa điểm
Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật , tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), quang phổ k , nồi kh trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa K ), pH k Orion 420A (Hoa K ), cân điện t Satorius (Đức), lò vi sóng Panasonic (Thái lan), máy ly tâm, tủ lạnh -40C Akira (Việt Nam) và tủ lạnh -4o
C Akira (Việt Nam), máy ch p ảnh kỹ thuật số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu.
Dụng cụ: Eppendorf centrifuge 5417 (Đức), bộ micropipette (Bio-Rad) P10, P20, P200, P1000 (Đức), ống nghiệm, bình tam giác 50 ml, 100 ml, đĩa petri (Đức), ống nghiệm 15 ml (Đức) và một số d ng c khác như: kính lúp, que cấy, que thủy tinh, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, ống đong, đèn cồn,…
Hóa chất: Ethanol 95%, agar, acid sulfuric (H2SO4) đậm đ c, natri clorua (NaCl), K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, n-octanol (C8H18O), acetone, Sodium hidroxide (NaOH), acetate buffer,...
Địa điểm: phòng thí nghiệm Sinh Hóa, PTN Công nghệ Enzyme, PTN Vi Sinh Thực phẩm, PTN Vi sinh vật thuộc Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Hình 5: Một số thiết bị 3.1.2. Nguyên vật liệu
B mía: sau khi thu từ nhà máy đường Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang được sấy ở 70oC trong 30 - 45 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích thước lỗ lưới là 0,2mm. Bột b mía sau khi nghiền được r a với nước lọc nhiều lần để loại đường.
Nguồn vi khuẩn do phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme cung cấp bao gồm: - Ba dòng vi khuẩn dạ c bò: BM13 (Achromobacter xylosoxidans BL6); BM21 (Bacillus subtilis S20) và BM49 (Bacillus subtilis FS321)
- Hai dòng vi khuẩn dạ c trâu: TM9, TM11 (Achromobacter xylosoxidans).
- Hai dòng vi khuẩn dạ c cừu: CD11 (Achromobacter piechaudii M52) và CD43 (Bacillus tequilensis TXJB 020)
- Hai dòng vi khuẩn dạ c dê: DD9 (Bacillus subtilis RC24) và DD7 (Bacillus subtilis BA3_1A).
3.1.3. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật
Bảng 4: Thành phần môi trƣờng rắn cải tiến (M1)
Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể
tích Đơn vị Bột b mía (NH4)2SO4 KH2PO4 K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl Agar Nước 10 1 1 1 0,5 0,001 20 1000 gram gram gram gram gram gram gram ml
(* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh, 2010)
Môi trƣờng lỏng Ryckeboer ( 2003) cải tiến
Bảng 5: Thành phần môi trƣờng lỏng cải tiến (M2) Tên hóa chất Khối lƣợng/ Thể tích Đơn vị
Bột b mía (NH4)2SO4 KH2PO4 K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl Nước 10 1 1 1 0,5 0,001 1000 gram gram gram gram gram gram ml
Môi trƣờng khoáng Ryckeboer (2003):
Bảng 6: Thành phần môi trƣờng khoáng Ryckeboer (2003) (M3) Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể tích Đơn vị
(NH4)2SO4 1 Gram
K2HPO4 1 Gram (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
MgSO4.7H2O 0,5 Gram
NaCl 0,001 Gram
Nước 1000 Ml
(* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh., 2010)
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 3.2.1. Khảo sát nguyên liệu 3.2.1. Khảo sát nguyên liệu
Mục đích: Đánh giá nguyên liệu trước khi thực hiện thí nghiệm để so sánh với k t quả sau khi dùng vi khuẩn phân giải.
Mẫu: Bã mía.
Các chỉ tiêu khảo sát: Hàm lượng vật chất khô, tro, hàm lượng xơ thô, hàm lượng hemicellulose, hàm lượng cellulose và hàm lượng lignin.
a) Hàm lƣợng vật chất khô (DM)
Nguyên tắc: Dùng nhiệt làm bay hơi nước có trong nguyên liệu. Phần còn lại là vật chất khô của nguyên liệu (AOAC, 1993).
Tiến hành
Sấy 2g b mía ở 70o
C cho tới khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích.
Hàm lượng vật chất khô được tính theo công thức:
X = m1*100/m (%)
Trong đó
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g) m1: Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g)
(*Nguồn: AOAC, 1993)
b) Hàm lƣợng hemicellulose (Neutral Detergent Fiber-NDF, Acid Detergent Fiber-ADF)
Nguyên tắc: dựa trên sự chênh lệch giữa 2 chỉ số NDF và ADF (Reed và Van Soest, 1985).
Tiến hành
Hàm lƣợng NDF (Neutral Detergent Fiber)
1g b mía được x lý hoàn lưu với dung dịch trung tính NDF, n-octanol và Na2SO3 với nhiệt trong 60 phút. Sau đó r a 3 lần với nước nóng và 2 lần với acetone. Sấy mẫu thu được ở 70o
C cho tới khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích.
Hàm lượng NDF được tính theo công thức:
X1 = m1*100/m (%)
Trong đó
m: Trọng lượng mẫu ban đầu (g) m1: Trọng lượng mẫu sau khi sấy (g)
X1: Phần trăm NDF trong mẫu phân tích (%)
(*Nguồn: Van Soest và Wine, 1967) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hàm lƣợng ADF (Acid Detergent Fiber)
1g b mía được x lý hoàn lưu với dung dịch acid và n-octanol với nhiệt trong 60 phút. R a 3 lần với nước nóng và 2 lần với acetone. Sấy mẫu thu được ở 70oCcho tới