− Thời gian: từ tháng 01/2014 – 4/2014
− Địa điểm: Nhà chú Nguyễn Trung Nghiên, 360, Vành Đai Phi Trƣờng, An Thới, Bình Thủy, Cần Thơ và phòng thí nghiệm Sinh học Phân Tử Thực Vật ,Viện NC&PT Công nghệ sinh học, khu II Đại học Cần Thơ.
3.2. Phương tiện
3.2.1. Vật liệu
− Bã mía: thu từ nhà máy đƣờng Phụng Hiệp – Hậu Giang.
Bã mía sau khi thu từ nhà máy đƣờng Phụng Hiệp – Hậu Giang đƣợc vận chuyển đến trại nấm quận Ninh Kiều-TP Cần Thơ. Trƣớc khi trộn với phân bã mía đƣợc bóp nhuyễn, tƣới nƣớc cho độ ẩm lên đến khoảng 70% - 80%.
− Phân dê: thu từ trại chăn nuôi hộ gia đình ở huyện Bình Minh –Vĩnh Long . − Trùn Quế: mua giống ở trại trùn Quế Long Thành – Tiền Giang
3.2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
a) Hóa chất:
Phƣơng pháp đo đạm tổng (Kjeldahl): - Dung dịch NaOH 30%,
- Thuốc thử acid boric 2% chứa brommocresol green (0,0065g/l) và methyl đỏ (0,013g/l) - Dung dịch H2SO4 chuẩn 0,1N - H2SO4 đậm đặc - Xúc tác đốt đạm (100g K2SO4, 10g CuSO4, 1gSe)
Phƣơng pháp đo lipid (Sohxlet):
- Ether dầu hỏa
- Ether ethylic
- Acid acetic đậm đặc
- Cloroform
- Dung dịch KI bão hòa
- Na2S2O3 0,01N
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT CNSH
20
- Dung dịch phenolphthalein 1% trong ethanol - Dung dịch cồn- ammonia:
o Ethanol 900 208,5ml
o NH4OH đđ 7,5ml
o Nƣớc cất vừa đủ 250ml
Phân tích hàm lƣợng IAA (Indol Acetic Acid): - H2SO4 đậm đặc 10,8M.
- FeCl3
- dung dịch IAA chuẩn 500 ppm
- thuốc thử Salkowsky - Nƣớc cất Xác định tỉ lệ C/N Walkley-Black - Dd K2Cr2O7 - Dd H2SO4 đậm đặc - Dd H3PO4 - FeSO4 1N
Xác định P (Theo tiêu chuẩn TCVN 8563 : 2010):
- Dung dịch 1(amoni molypdat 12,5 % trong H2SO4 5 N): [(NH4)8 Mo7O24-4H2O]
(H2SO4) d = 1,84
- Dung dịch 2, Kali antimoantartrat 0,06 % (W/V trong nƣớc). - Dung dịch 3, Axit ascorbic 2 % (W/V trong nƣớc
- 2 giọt chỉ thị dinitrophenol. - NH4OH 10 %.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT CNSH
21 - Dung dịch phospho gốc nồng độ 100 mg P/l Xác định Coliform, E.coli, Samonela:
Dung dịch pha loãng
- NaCl 9g
- KCl 0,42g
- CaCl2 0,48g
-Hydrogenocarbonate natri 0,2g
-Nƣớc cất 1000ml
Canh thang Tryptone et Lauryl Sulfat natri (TLS)
Nồng độ đơn - Tryptone 20g - Lactose 5g - K2HPO4 2,75g - KH2PO4 2,75g - NaCl 5g
- Natri lauryl sulfat CH3(CH2)11OSO3Na 0,1g
- Nƣớc cất 1000ml
Môi trường xanh lục sáng (Brilliant Green Bile Broth - BGBL)
Nồng độ đơn
- Peptone bacteriologique 10g
- Bile de boeuf (muối mật) 10g
- Lactose 20g
- Vert brillant 0,0133g
- Nƣớc cất 1000ml
Môi trƣờng peptone d’indol
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT CNSH
22
- NaCl 5g
- Nƣớc cất 1000ml
Thuốc thử Kovac’s
- P. methyl amino bezandehyde 5g
- Alcool amylique 75ml - HCl 25ml b) Dụng cụ Thí nghiệm: - Nồi khử trùng nhiệt ƣớt 1210C. - Tủ ủ 370C, 44,50C. - Bếp đun cách thủy 450C, 500C 10C. - Đĩa petri - Ống nghiệm - Bình tam giác 100, 250, 500 ml - Chai lọ thủy tinh
- Ống đong
- Đầu cone xanh, vàng , trắng - Các loại ống tuýt 1,5ml; 2,5ml - Bộ Micropipet - Eppendoft - Que cấy - Đèn cấy - pH kế
- Hệ thống vô cơ hóa mẫu
- Máy lôi cuốn đạm - Bình Kjeldahl - Buret 25ml - Buret 10 ml - Hệ thống Sohxlet - Bình tam giác 100ml - Phễu chiết - Chai nhỏ giọt - Giấy lọc - Cốc nhôm - Máy đo OD
- Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ đến 105oC; - Cân phân tích chính xác đến 0,0001g; - Bình hút ẩm;
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT CNSH
23
3.2.3. Phương pháp nghiên cứu.
3.2.3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của mật độ trùn Quế đến khả năng phân hủy phân Dê
a) Mục đích
Xác định mật độ trùn Quế phù hợp để xử lý hiệu quả phân Dê.
b) Bố trí thí nghiệm
- Sử dụng 15 thùng xốp có kích thƣớc bằng nhau: 0,5 m x 0,6 m; cao 0,45 m.
- Đáy thùng xốp đƣợc đục lỗ rộng 7mm, cách nhau 5cm và đƣợc lót giấy carton (vỏ thùng mì gói), để ở nơi thoáng mát.
- Phân Dê đã ủ 1 tháng trƣớc khicho trùn ăn.
- Bố trí thí nghiệm theo bảng dƣới đây:
Nghiệm thức Tỉ lệ trùn giống so với khối
lƣợng phân (%) Khối lƣợng phân dê (kg)
ĐC 0 4
NT1 2 4
NT2 3 4
NT3 4 4
NT4 5 4
- Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
- Sinh khối ban đầu đƣợc bổ sung 1kg (ở các nghiệm thức 1, 2, 3 và 4) để tạo môi trƣờng cho trùn thích nghi dần với môi trƣờng mới, tránh trƣờng hợp trùn bị sốc phân và chết ảnh hƣởng đến kết quả thí nghiệm.
c) Cách tiến hành
Chuẩn bị nguồn phân ủ
Vì trùn quế rất sợ nƣớc tiểu gia súc nên phân dê sau khi đƣợc đƣợc thu về phải đƣợc ủ trƣớc khi cho trùn xử lý. Trải phân dê lên nền xi măng cao ráo, tƣới nƣớc trộn
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT CNSH
24
đều, sau đó đậy kín đống ủ. Trong quá trình ủ phải theo dõi tƣới nƣớc để đảm bảo độ ẩm của đống phân ủ. Thời gian ủ phân là từ 3 – 4 tuần là tiến hành cho trùn xử lý. Mỗi nghiệm thức có bổ sung trùn đều cho xử lý khối lƣợng phân bằng nhau là 4kg. Thƣờng xuyên kiểm tra thùng nuôi để biết trùn ăn hết thức ăn hay chƣa để bổ sung thêm không để trùn bị đói hoặc thừa thức ăn.
Thả trùn giống
Trùn giống đƣợc thả nuôi khi nguồn phân ủ và thùng nuôi đã chuẩn bị xong. Giống trùn chọn thả phải đảm bảo về hình dáng và kích thƣớc đặc trƣng của giống, đa số trùn có màu đỏ đậm, chui xuống luống nuôi hoặc vận động không quá chậm khi bị bắt. Thả trùn trực tiếp vào thùng nuôi đã bổ sung 1kg chất đệm, sau hai giờ thì tƣới nƣớc và sau một ngày thì tiến hành cho ăn và chăm sóc.
Theo dõi và chăm sóc
Kiểm tra độ ẩm bằng cáchlấy tay nắm chặt phần sinh khối trong ô nuôi sau đó thả ra, nếu thấy phần sinh khối còn giữ nguyên và tay ta chỉ ƣớt là đủ, nhƣng nếu thấy nƣớc chảy ra hoặc phần sinh khối bị vỡ và rơi xuống nhƣ vậy là quá ƣớt hoặc quá khô.
Nếu quá ƣớt thì ngừng tƣới nƣớc đến lần kiểm tra tiếp theo. Nếu phần sinh khối bị khô thì dùng bình xịt tƣới nƣớc ngay cho những phần sinh khối bị khô.
Kiểm tra lƣợng thức ăn của lần cho ăn trƣớc, nếu thấy phần thức ăn trong ô nuôi sắp hết (trùn đã xử lý xong phần phân bổ sung vào) thì tiến hành cho trùn ăn lần tiếp theo. Dùng tay (có bao tay) hay xẻng nhỏ lấy từng mảng phân bỏ vào luống nuôi, mảng phân đƣờng kính 10cm cao 2cm, các mảng phân cách nhau 10cm. Sau đó tƣới nƣớc đều trên luống trùn để giữ độ ẩm cho luống nuôi và mảng phân. Nếu mảng phân khô thì tốc độ ăn của trùn sẽ giảm, do đó phải đảm bảo mảng phân luôn ẩm ƣớt.
d) Các chỉ tiêu theo dõi
− Ghi nhận sự thay đổi nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ không ảnh hƣởng quá nhiều đến thời gian xử lý cũng nhƣ sự phát triển của trùn ở các thời điểm khác nhau của từng nghiệm thức và giữa các nghiệm thức với nhau.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT CNSH
25
Phương pháp: Dùng nhiệt kế cắm thẳng góc vào ô nuôi rồi ghi nhận nhiệt độ tại thời điểm kiểm tra, lấy nhiệt độ trung bình của 3 ô nuôi. Năm ngày kiểm tra nhiệt độ một lần. Mỗi lần kiểm tra nhiệt độ của ô nuôi vào lúc 13 giờ chiều
−Ghi nhận kết quả đánh giá cảm quan của phân dê tƣơi, phân dê sau khi ủ 30 ngày và phân dê đã đƣợc xử lý bởi trùn quế
− Phương pháp: chỉ tiêu cảm quan đƣợc đánh giá phụ thuộc vào mức độ hôi của phân dê. Có 4 mức độ đánh giá là rất hôi, khá hôi, hôi ít và không hôi. Phiếu đánh giá cảm quan đƣợc gửi đến 20 ngƣời ngẫu nhiên gần khu vực thí nghiệm và đƣợc thống kê lại thành bảng đánh giá cảm quan.
− Ghi nhận thời gian phân dê đƣợc xử lý (phân dê không còn mùi hôi và đã mùn hóa) ở các nghiệm thức để so sánh thời gian xử lý ở các nghiệm thức nhằm cho thấy hiệu quả xử lý phân dê bằng trùn quế.
Phương pháp: Dựa vào sự đánh giá cảm quan để xác định thời gian phân dê đã đƣợc xử lý hoàn toàn. Thời gian phân dê đƣợc xử lý đƣợc tính từ khi cho trùn ăn (xử lý) lần đầu tiên đến khi trùn ăn xong lần cuối cùng. Theo dõi quá trình xử lý của trùn, nếu phân ở nghiệm thức nào sắp hết thì tiến hành bổ sung ngay để đảm bảo thời gian xử lý của trùn không bị gián đoạn. Nếu nghiệm thức nào xử lý 4 kg phân dê không còn mùi hôi thì kết thúc nghiệm thức đó và ghi nhận thời gian phân hủy, khối lƣợng trùn thu đƣợc.
− Ghi nhận sự thay đổi khối lƣợng của các nghiệm thức có bổ sung trùn để biết đƣợc mật số thả nuôi nào sẽ cho kết quả trùn phát triển tốt nhất. Đồng thời kết hợp với thời gian xử lý để lựa chọn mật số trùn phù hợp trong thí nghiệm tiếp theo.
Phương pháp:
Vì mật số thả nuôi ở các nghiệm thức khác nhau nên thời gian kết thúc các nghiệm thức là khác nhau. Nghiệm thức nào xử lý xong trƣớc thì tiến hành thu hoạch nghiệm thức đó trƣớc và tiếp tục chăm sóc cho các nghiệm thức còn lại.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT CNSH
26
Trùn đƣợc thu hoạch vào buổi sáng sớm hoặc chiều mát. Trải toàn bộ sinh khối trong ô nuôi đang thu hoạch trùn lên một tấm nylon đƣợc trải sẵn nơi có nắng. Vì trùn rất sợ ánh sáng nên khi có nắng chúng sẽ chui xuống lớp dƣới.
Thu lấy phần sinh khối phía trên (đây là phần phân sau khi xử lý) để dùng làm sinh khối cho thí nghiệm sau. Thu lấy và cân toàn bộ trùn ở phía dƣới, dùng cân có độ chính xác 2 số lẻ cân và ghi nhận lại kết quả để so sánh với nghiệm thức khác. Sau khi thu hoạch thì toàn bộ trùn thu hoạch đƣợc thả nuôi lại ô nuôi vừa thu hoạch và tiếp tục chăm sóc để làm giống cho thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của tỉ lệ chất xơ độn đến sự phát triển của trùn Quế
a) Mục đích
Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ chất xơ độnđến sự phát triển của trùn Quế từ đó xác định tỉ lệ chất độn phù hợp để đạt hiệu quả phân hủy phân Dê cao nhất.
b) Bố trí thí nghiệm
- Thùng có thiết kế theo tỉ lệ trùn Quế cho kết quả phát triển tốt nhất ở nội dung thí nghiệm 1. chọn tỉ lệ trùn giống phù hợp từ kết quả thí nghiệm 1 để bổ sung vao NT1,NT2, NT3, NT4 và ĐC
- Bố trí thí nghiệm:
Nghiệm thức Tỉ lệ chất độn (%) Khối lƣợng phân (kg)
ĐC 0 4
NT1 30 4
NT2 50 4
NT3 70 4
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT CNSH
27 - Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần
- Sinh khối ban đầu đƣợc bổ sung 1kg để tạo môi trƣờng cho trùn thích nghi dần với môi trƣờng mới, tránh trƣờng hợp trùn bị sốc phân và chết ảnh hƣởng đến kết quả thí nghiệm.
c) Cách tiến hành
Các bƣớc chuẩn bị nhƣ nguồn phân ủ, chuẩn bị ô nuôi, theo dõi và chăm sóc đƣợc thực hiện tƣơng tự thí nghiệm 1. Nhƣng đối với bƣớc chuẩn bị phân ủ thì nghiệm thức 1có bổ sung thêm 30% bả mía, nghiệm thức 2 bổ sung 50% bả mía và nghiệm thức 3 bổ sung 70% bả mía lúc trộn phân ủ. Đồng thời bổ sung vào các nghiệm thức khối lƣợng trùn nhƣ nhau là 120g trùn và tiến hành khảo sát sự ảnh hƣởng của tỉ lệ phối trộn giữa bã mía và phân heo trong thời gian là 60 ngày
d)Các chỉ tiêu theo dõi
− Ghi nhận sự phát triển của trùn vào cuối thí nghiệm để so sánh sự khác biệt về sự phát triển của trùn ở các nghiệm thức
Phương pháp: Thời gian thực hiện thí nghiệm là 60 ngày. Sau khi kết thúc thí nghiệm thì trùn ở các ô nuôi đƣợc thu lấy tƣơng tự thí nghiệm 1. Dùng cân có độ chính xác 2 số lẻ cân và ghi nhận lại khối lƣợng trùn để so sánh các nghiệm thức với nhau.
− Mẫu thịt trùn ở các nghiệm thức đƣợc thu lấy để tính độ và tính hàm lƣợng protein tổng số dựa vào hàm lƣợng nitơ tổng số nhằm khảo sát sự ảnh hƣởng của thành phần thức ăn đến hàm lƣợng protein của trùn.
− Các mẫu phân trƣớc và sau khi đƣợc xử lý bằng trùn ở các nghiệm thức đƣợc sử dụng khảo sát các chỉ tiêu sau:
Hàm lƣợng Carbon hữu cơ (Walkley-Black, 1934) (Mục 1, Phụ lục 1). Xác định hàm lƣợng Nitơ tổng số (Kjeldalh, 1883) (Mục 2, Phụ lục 1). Xác định tỷ lệ carbon/nitrogen (C/N) (Mục 3, Phụ lục 1).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT CNSH
28
Xác định hàm lƣợng lân hòa tan bằng phƣơng pháp Oniani (Mục 6, Phụ lục 1).
Phân tích hàm lƣợng IAA(Indol Acetic Acid) (Mục 7, Phụ lục 1).
Chỉ tiêu Coliform và E.coli bằng phƣơng pháp MPN (Phƣơng pháp NF
ISO 4831, NF V08-016) (Mục 8, Phụ lục 2).
3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc trình bày dạng bảng, kết quả đƣợc xử lý trên phần mềm Excel và phần mềm Minitab 16.0.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT CNSH
29
Chƣơng 4 : KẾT QUẢ
4.1. Ảnh hưởng của mật sộ trùn Quế đến khả năng phân hủy phân dê
4.1.1. Ảnh hưởng mật số trùn Quế đến thời gian mùn hóa phân dê.
Hình 1: Biểu đồ thời gian mùn hóa phân dê theo các nghiệm thức.
Ghi chú: ĐC: Nghiệm thức đối chứng không có trùn ; NT1: Nghiệm thức có 2% trùn ; NT2: Nghiệm thức có 3% trùn ; NT3: Nghiệm thức có 4% trùn ; NT4: Nghiệm thức có 5% trùn .Các ký tự theo sau khác nhau thể hiện khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95%.
Qua kết quả thống kê bảng 25 và biểu đồ hình1 ta thấy thời gian phân dê đƣợc phân hủy hết giữa các nghiệm thức có trùn Quế và đối chứng khác biệt có ý nghĩa thống kê (độ tin cậy 95%). Các nghiệm thức có sử dụng trùn Quế để xử lý phân dê có thời gian mùn hóa nhanh hơn so với nghiệm thức ĐC. Cụ thể NT1 nhanh hơn ĐC là 2,27 lần; NT2 nhanh hơn ĐC 3,76 lần; NT 3 nhanh hơn ĐC 4,38 lần; NT4 nhanh hơn ĐC 5,80 lần. Phân dê là một trong những loại phân gia súc có đặc tính phù hợp cho trùn Quế làm thức ăn (Nguyễn Lân Hùng, 2010), mặt khác trong hệ thống tiêu hóa của trùn Quế hệ VSV phong phú nhƣ xạ khuẩn, vi khuẩn…có tác dụng phân hủy và khử mùi mạnh mẽ (Partidar, A. 2012) nên nhóm vi sinh vật này đã đẩy nhanh quá trình phân hủy phân dê hơn so với phân dê để ở nghiệm thức ĐC.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT CNSH
30
Nghiệm thức NT4 có thời gian mùn hóa nhanh nhất là 19,67 ngày với tỉ lệ trùn cao nhất là 5%, NT1 có thời gian mùn hóa là 50,33 ngày lâu nhất trong các nghiệm thức có sử dụng trùn Quế với lƣợng bổ sung 2%. Ở NT2 bổ sung 3% trùn có thời gian là 30,3 ngày lâu hơn NT3 là 4,33 ngày và nhanh hơn NT1 là 20 ngày mặc dù mật số bổ sung chỉ lớn hơn NT1 và nhỏ hơn NT3 có 1%, trong khi đó mật số trùn NT3 cũng nhỏ hơn NT4 1% nhƣng lâu hơn NT4 đến 6,33 ngày. Điều đó chứng tỏ không phải mật số trùn càng tăng cao cũng đồng nghĩa với tốc độ mùn hóa càng nhanh.
Từ kết quả trên chứng tỏ trùn Quế có khả năng đẩy nhanh thời gian mùn hóa phân dê so với phân dê để ở điều kiện không xử lý. Để xử lý phân hiệu quả và cho lƣợng tăng sinh khối cao thì NT2 cho hiệu quả nhất.