2.3.2.1.Bố trí thí nghiệm
+ Thời vụ: Vụ mùa năm 2014
+ Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô 1 giống, các tổ hợp được bố trí tuần tự không nhắc lại, mỗi giống cấy 5 m2
+ Khoảng cách: Hàng cách hàng 20 cm, cây cách cây 11 cm, cấy 1 dảnh. + Mật độ cấy: 45 cây/m2
+ Kỹ thuật trồng và chăm sóc:
- Cày bừa, làm giầm đất, nhặt cỏ sách sẽ, san phẳng ruộng. - Gieo mạ, gieo theo đúng luống, ô.
- Bón phân: Bón phân, chăm sóc nhưđại trà: Lượng bón: 120kg N + 90kg P2O5 + 60kg K2O /ha Cách bón:
+ Bón lót: 100% P2O5 + 20% N sau lần bừa cuối cùng, giữ mực nước thấp. + Bón thúc lần 1: 50% N + 40% K2O thúc đẻ nhánh kết hợp làm cỏ sục bùn, giữ mực nước 12 cm.
+ Bón thúc lần 2: toàn bộ lượng phân còn lại , bón vào lúc bước vào giai
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
- Làm cỏ: Trộn thuốc trừ cỏ với đạm qua các lần bón phân.
- Phun thuốc: Phun 2 giai đoạn, phòng trừ sâu đục thân, cuốn lá và bệnh khô vằn. Phòng trừ kịp thời khi thấy xuất hiện dấu hiệu bệnh.
2.3.2.2. Chọn lọc các cá thể tốt
Để chọn lọc được các cá thể tốt mang gen kháng bệnh bạc lá, trước tiên ta phải chọn được các cá thể có đặc điểm nông sinh học tốt và năng suất cao. Chọn lọc cá thể tốt được tiến hành qua 3 giai đoạn:
*Giai đoạn đẻ nhánh: Chọn 30 cá thể dựa vào khả năng đẻ nhánh (không chọn những cây ở hàng ngoài) của các cá thể trong mỗi tổ hợp. Chọn những cá thể
sinh trưởng phát triển tốt, đẻ nhánh tập trung, có 6-8 nhánh trở lên, các nhánh đều to, các cá thể xung quanh của cá thể được chọn còn nguyên, không bị sâu bệnh. Cắm thẻ theo dõi và tiến hành thu mẫu từng cá thểđể tách chiết DNA.
*Giai đoạn trỗ: Từ những cá thể cắm thẻ theo dõi, chọn ra những cá thể trỗ đều, có 6 – 7 nhánh hữu hiệu trở lên ở lúa tẻ hoặc 4 – 6 nhánh hữu hiệu trở lên ở lúa nếp, thời gian trỗ ngắn, không nhiễm sâu bệnh. Giai đoạn này chọn 15 – 20 cá thể.
*Giai đoạn chín: Tiếp tục chọn ra những cá thể tốt nhất, có it nhất 4 - 6 bông hữu hiệu/ khóm, chín sớm, năng suất cao, số hạt chắc/bông đạt 150 - 200 hạt trở lên, không nhiễm sâu bệnh, gạo trong không bị bạc bụng. Chọn 10 – 15 cá thể tốt.
Sau khi có kết quả theo dõi một sốđặc điểm nông sinh học, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các cá thể đánh dấu, tiến hành chọn lọc cá thể tốt bằng phương pháp chọn lọc cá thể mang gen kháng bệnh bạc lá và mang gen thơm bằng chỉ thị phân tử DNA.
2.3.2.3. Phương pháp đánh giá một sốđặc điểm nông sinh học cơ bản
Các đặc điểm nông sinh học được khảo sát theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá cây lúa của IRRI, 2002”
Xác định thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng - Từ cấy đến bắt đầu trỗ
- Từ trỗđến chín
Sau đó tính tổng thời gian sinh trưởng từ ngày gieo đến ngày lúa chín hoàn toàn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
cao cây cuối cùng, Đo chiều dài, chiều rộng hạt thóc
Đặc điểm nông sinh học thời kỳ chín liên quan đến năng suất: Số bông hữu hiệu/khóm, số hạt chắc/bông, khối lượng 1000 hạt, năng suất tiềm năng
- Năng suất tiềm năng = A x B x C x D x 10-4 Trong đó: A: Số khóm/m2 (45 khóm/m2) B: Số bông hữu hiệu/khóm C: Số hạt chắc/bông chính D: Khối lượng 1000 hạt Với mỗi giai đoạn quan sát, tiến hành lập bảng.
Cụ thể hiện nay các chỉ tiêu theo dõi được tiến hành theo QCVN 01- 56:2011/Bộ NNPTNT:
+ Thời gian sinh trưởng: Tổng số ngày từ khi gieo đến lúc hạt chín (85% số
hạt trên bông đã chín).
+ Số nhánh tối đa trên khóm: Đếm số nhánh trong giai đoạn lúa vươn lóng làm đòng.
+ Số nhánh hữu hiệu/ khóm: Số nhánh có khả năng tạo thành, theo dõi giai
đoạn trỗ.
+ Chiều cao cuối cùng: đo từ gốc đến đầu mút bông không kể râu, đo giai
đoạn chín sữa đến khi chin sáp.
+ Số bông hữu hiệu/khóm: số bông có từ 10 hạt chắc trở lên.
+ Số hạt/bông, số hạt chắc, tỷ lệ hạt chắc/bông: theo dõi 3 bông/cá thể. + Cân năng suất cá thể: khối lượng của tất cả các hạt chắc trên cá thể.
2.3.2.4. Phương pháp đánh giá cảm quan mùi thơm
Theo Sood và Siddiq, 1978, mùi thơm được đánh giá cảm quan như sau: Mùi thơm trên lá
Thu 10 lá của mỗi mẫu tổ hợp lai ở giai đoạn lúa đẻ nhánh rộ. Lấy 1g lá, cắt thành những đoạn dài 5 mm, bỏ vào ống nghiệm, ngâm với 5ml dung dịch KOH 1,7%, đậy nắp lại và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Mức độ thơm được chấm
điểm theo 3 mức rồi lấy trung bình.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
Mùi thơm của gạo
Lấy 10 hạt của mỗi tổ hợp lai, vừa mới thu hoạch, bóc vỏ, làm trắng rồi nghiền nhỏ. Bột gạo của mỗi tổ hợp lai được cho vào một ống chứa 500µl KOH 1,7%, đậy nắp và đểở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đánh giá mùi thơm cũng bằng phương pháp ngửi cảm quan rồi cho điểm như trên.
2.3..3 Thí nghiệm trong phòng
2.3.3.1. Phương pháp tách chiết DNA
Quy trình chiết tách DNA theo Phan Hữu Tôn, 2000 và Zheng và cộng sự, 1995 gồm các bước sau :
Bước 1: lá cây khỏe thu vào buổi sáng, cắt dài khoảng 2cm bỏ vào ống nghiệm có dung tích dài 1.5ml, đánh dấu tên tổ hợp lai bỏ vào đá lạnh .
Bước 2: Trong phòng thí nghiệm các cối chày sứ đã được khử trùng đặt trong đá lạnh, các mẫu lá được cắt nhỏ khoảng 0.5cm vào cối sứ .
Bước 3: nhỏ 400µl dung dịch chiết tách DNA vào cối sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫu lá cho đến khi dịch chiết chuyển sang màu xanh đen .
Bước 4: nhỏ thêm 400µl dung dịch chiết tách DNA vào, trộn đều và chuyển dung dịch này vào ống nghiệm đã đánh dấu cùng giống .
Bước 5: cho vào ống nghiệm 400µl dung dịch hỗn hợp Phenol : chloroform : Isolamyl alchohol (25:24:1). Sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút ở
nhiệt độ 40C rồi chuyển phần dung dịch phía trên sang ống nghiệm được đánh dấu cùng tổ hợp lai.
Bước 6: cho thêm 400µl dung dịch chloroform: Isolamyl alchohol (24:1) sau
đó ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong vòng 3 phút rồi chuyển phần dung dịch phí trên sang ống nghiệm đã được đánh dấu cùng tổ hợp lai.
Bước 7: Cho 800µl ethanol 96% trộn đều sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 40C, đổ phần dung dịch phía trên giữ lại phần kết tủa dưới
đáy ống nghiệm .
Bước 8: Rửa kết tủa bằng ethanol 70% và để khô tự nhiên bằng cách úp ngược
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
Bước 9: hòa tan kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ 40C và sử dụng 1µl cho phân tích PCR.
2.3.3.2. Thành phàn các dung dịch tham gia chiết tách
Bảng 2.2. Thành phần dung dịch chiết tách Thành phần Nồng độ dd mẹ Nồng độ dd làm việc Hỗn hợp 50ml dd chiết tách Tris-HCl pH=8 1M 50mM 2,5ml EDTA pH=8 0.5M 0.25mM 2,5ml NaCl 5M 300mM 3,0ml SDS 10% 1% 5,0ml H2O 37,0ml Bảng 2.3. Thành phần dung dịch TE Thành phần Nồng độ dd mẹ Nồng độ dd làm việc Thể tích 50ml Tris-HCl 1M 10mM 0,5ml EDTA 0.5M 1mM 0,1ml H2O 49,4ml
2.3.3.3. Kỹ thuật PCR dùng trong phát hiện gen kháng bệnh bạc lá và gen mùi thơm
Quy trình phản ứng PCR: sau khi cho đủ các thành phần phản ứng và DNA cần nhân vào ống PCR (các ống này được đánh số theo thứ tự) sau đó cho vào trong máy nhân gen để chạy phản ứng PCR. Đặt chu kì nhiệt cho phản ứng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
a, Kỹ thuật PCR dùng trong phát hiện gen kháng bệnh bạc lá
Quy trình PCR xác định gen kháng bệnh bạc lá do GS.TS.S. Taura và cộng sựđề xuất. Bảng 2.4. Thành phần cho 1 phản ứng PCR phát hiện gen kháng bạc lá STT Thành phần Nồng độ gốc Thểlấ tích cy(µl) ần 1 H2O 13,3 2 PCR buffer (có chứa Mg2+) 10X 2,0 3 dNTPs 2,5mM 1,6
4 Primer Forward 10 pmol/µl 1,0
5 Primer Reverse 10 pmol/µl 1,0
6 DNA taq polymerase 5unit/µl 0,1
7 Tổng thể tích cocktail 19,0
8 DNA mẫu 1 µl 1,0
9 Tổng thể tích 20 (µl)
Nếu PCR không chứa Mg2+ thì phải bổ sung thêm Mg ở nồng độ cuối cùng bằng 0.5- 1.5 mM.
Bảng 2.5. Các Primer dùng trong PCR phát hiện gen kháng bạc lá lúa
Gen KH mồi NST Trình tự mồi cách cM Khoảng Tác giả
Xa4 MP2 11 F: 5’ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG 3’ R: 5’GTG CTA TAA AAG GCA TTC GGG 3’ 1.7cM N. Furuya et al, 1992
Xa7 P3 6 F 5’ CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT 3’
R 5’ CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA 3’. 2.5 cM
Taura và cs. (2004)
- Chu trình PCR nhân gen
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7
Bước Tác dụng Nhiệt độ ( 0C ) Thời gian Số chu kỳ
1 Biến tính 94 2 phút 1 2 Biến tính 94 30s 34 Gắn mồi 58 30s Tổng hợp 72 30s 3 Biến tính 72 5 phút 1 4 Bảo quản 4 - Chạy điện di sản phẩm xác định gen kháng bạc lá lúa :
Sau khi kết thúc phản ứng PCR tiến hành điện di sản phẩm nhân gen đối với gen Xa4 và Xa7 bằng agarose 1,5%.
- Chuẩn bị gel agarose 1,5%: Cân 1,5g agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun sôi đến khi tạo gel agarose trong suốt. Để gel nguội đến nhiệt độ
khoảng 500C, đổ vào khuôn và để gel cứng lại trong 15 phút. - Chạy điện di :
+ Trộn 9µl sản phẩm PCR với 1µl Loading buffer 10X, nhỏ hỗn hợp vào giếng agarose.
+ Chạy điện di ở 100V, 110mA trong khoảng 25 phút .
- Sau khi chạy điện di xong nhuộm sản phẩm DNA trong gel agarose bằng ethilium bromide nồng độ 10mg/ml trong 15 phút.
- Quan sát vệt băng dưới đèn chiếu tia UV và chụp ảnh bản điện di.
Phát hiện gen kháng Xa4 và Xa7 bằng cách so sánh các vạch băng của mẫu nghiên cứu với DNA Ladder và vạch băng của giống đối chứng (đối chứng là các giống bố mẹ). Với gen Xa4, mẫu có gen kháng ĐHT thì kích thước vạch băng thu
được khoảng 150pb, mẫu không chứa gen kháng thì vạch băng có kích thước khoảng 120bp, mẫu có gen kháng DHT thì có cả 2 vạch băng trên (Yoshimura và cộng sự, 1992); Nhận biết tương tự gen Xa7 với kích thước 2 vạch băng khoảng 297bp và 262bp (Furuya và cộng sự, 2003).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
b, Kỹ thuật PCR dùng trong phát hiện gen mùi thơm
- Trình tự mồi sử dụng phát hiện gen thơm fgr (Bradbury và cộng sự, 2005).
Bảng 2.7. Chỉ thị DNA sử dụng để phát hiện gen mùi thơm
KH mồi Trình tự mồi
ESP 5’-TTG TTT GGA GTC TGC TGA TG -3’
IFAP 5’-CAT AGG AGC AGC TGA AAT ATA TACC-3’ - Thành phần dung dịch phản ứng PCR với thể tích 25 µl gồm: Bảng 2.8. Thành phần cho 1 phản ứng PCR phát hiện gen thơm STT Thành phần Nồng độ dung dịch Thể tích (µl) 1 Nước vô trùng 13,8 2 PCR buffer 10X 2,5 3 dNTPs 10mM 0,5 4 Primer-F 10pmol /µl 2,5 5 Primer-R 10pmol /µl 2,5
6 DNA Tag polymerase 5 units /µl 0.2
7 DNA nguyên bản 5 ng /µl 1
8 MgCl2 25mM 2
9 Tổng 25
- Chu kì của phản ứng:
Bảng 2.9. Chu kỳ nhiệt cho gen thơm fgr
Bước Tác dụng Nhiệt độ ( 0C ) Thời gian Số chu kỳ
1 Biến tính 94 2 phút 1 2 Biến tính 94 5s 30 Gắn mồi 58 5s Tổng hợp 72 5s 3 Biến tính 72 5 phút 1 4 Bảo quản 4
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, 65V trong 45 phút.