Đến nay, nhiều chỉ thị phân tử như SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) hay SSRs (Simple Sequence Repeats) liên kết với gen fgrđã được áp dụng trong chọn lọc giống lúa thơm (Cordeiro et al., 2002).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20
liên kết với gen fgr ở khoảng cách 4,5cM. Theo tác giả, chỉ thị này có thể áp dụng
để dự đoán sớm sự có mặt của gen mùi thơm trên một giống lúa, phân biệt được tính trạng đồng hợp tử hay dị hợp tử của gen fgr và phát hiện nhanh mùi thơm trong các dòng lai (Ahn et al, 1993). Nghiên cứu của Li et al, năm 1996 đã kết luận tính trạng mùi thơm do 1 gen lặn nằm trên NST số 8 quy định đã củng cố thêm quan
điểm RG28 là một chỉ thịđặc hiệu cho gen thơm. Pandey et al, (1994, 1995) nghiên cứu về liên kết giữa RG28 và thơm bằng cách nghiên cứu tổ hợp lai chéo giữa giống có mùi thơm Pusa 751 với giống không thơm IR72 đã đưa ra kết luận chỉ thị RG28 có khoảng cách là 10cM với gen thơm thay vì 4,5cM như kết luận của Ahn (Pandey et al,. 1994, 1995).
Các cặp mồi thiết kế từ RG28 đã được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện nhanh các giống lúa thơm (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2002; Cordeido
et al., 2002; Jin et al., 2003). Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của các mồi này là chúng chỉ liên kết với gen thơm ở một mức độ nào đó nên không thể chính xác đến 100% (Hiền và cs., 2005; Louis M. T. Bradbury et al., 2005).
Bradbury et al, (2005) dựa vào cấu trúc và cơ chế hình thành của gen thơm đã sử dụng phương pháp ASA (Allele Specific Amplification) thiết kế một bộ mồi gồm 4 mồi là ESP, IFAP, EAP và INSP. Trong đó, ESP, EAP nhân cả vùng gen thơm, ESP và IFAP nhân gen lặn fgr, INSP và EAP nhân gen trội Fgr: không thơm. Với bộ
mồi này, phản ứng PCR sẽ nhân được 4 đoạn có kích thước như sau: một đoạn khoảng 580bp sẽ xuất hiện ở cả hai trường hợp thơm (577bp) và không thơm (585bp), một đoạn 355bp xuất hiện ở trường hợp đồng hợp tử trội Fgr/Fgr (không thơm), một đoạn 257bp xuất hiện ở trường hợp đồng hợp lặn fgr/fgr (thơm) và đối với trường hợp dị hợp tử Fgr/fgr (không thơm) sẽ xuất hiện đồng thời cả hai đoạn 355bp và 257bp. Bộ 4 mồi này có tính chính xác tới 100% do chúng được thiết kế từ
trình tự của chính gen mã hóa tổng hợp BAD2 (Robert Henr and Daniel Waters, 2006; Wakil Ahmad Sarhadi et al., 2008). Hoạt động của bộ mồi được minh họa ở hình 1.1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
Hình 1.1. Hoạt động của bộ 4 mồi được mô tả trong nghiên cứu của Bradburry và cộng sự (2005).
Shu Xia Sun et al, (2008) tiến hành kiểm tra gel thơm và không thơm trên lúa ở nhiễm sắc thể số 8 bằng kỹ thuật SSR với tám cặp mồi. Kết quả cho thấy rằng cặp mồi Ch - 29B và R2 không đa hình mà chỉ cặp mồi Aro7 đa hình, kích thước của cặp mồi Aro7 được xác định 302 bp. Ngoài ra, cũng xác định được mồi RM23097 liên kết với locus hương thơm với khoảng cách là 0,71 cM. Các gen thơm (fgr) được thể hiện giữa marker Aro7 (0,57 cM) và RM515 (0,71 cM). Dựa trên cơ sở liên kết phân tử và BAC (bacterial artificial chromosome) trên nhiễm sắc thể số 8 được xây dựng (hình 2) (Panaud O, X Chen and SR McCouch, 1996).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
CHƯƠNG 2 :VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu gồm 6 tổ hợp phân ly F2:
Bảng 2.1. Các tổ hợp phân ly F2 sử dụng trong nghiên cứu
STT Tổ hợp Ghi chú Mang gen
1 251F2 ( AIQ6 x IRBB4/7) Lúa tẻ IRBB4/7 chứa gen Xa4, Xa7 AIQ6: thơm
2 309F2 ( H56-2-2 x Hương thơm 1) Lúa tẻ H56-2-2 chứa gen Xa4, Xa7 Hương thơm 1: Thơm
3 392F2 ( LC2 x Bắc thơm 7) Lúa tẻ LC2: chứa gen Xa4, Xa7 Bắc thơm 7: Thơm
4 428F2 (10987 x 10861) Lúa nếp 10987: chứa gen Xa4, Xa7 10861: mang gen thơm
5 514F2 (KNL x 10921) Lúa nếp 10921: mang gen Xa4, Xa7 KLN: Thơm
6 526F2 (11278 x 10911) Lúa nếp 10911: mang gen Xa4, Xa7 11278: Thơm
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: nghiên cứu được tiến hành vào vụ mùa năm 2014.
- Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử và
được bố trí tại khu thí nghiệm đồng ruộng thuộc bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng và Trung tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Trâu Quỳ – Gia Lâm – Hà Nội.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá đặc điểm nông sinh học của 1 số cá thể tốt trong từng quần thể (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phân ly.
- Dùng kỹ thuật PCR phát hiện cây tốt có chứa gen kháng bạc lá và gen mùi thơm ở dạng đồng hợp trội và tìm được 1 số cây quy tụđồng thời nhiều gen kháng hữu hiệu và gen mùi thơm ở mỗi quần thể phân ly .
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Quy trình chọn lọc
2.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng
2.3.2.1.Bố trí thí nghiệm
+ Thời vụ: Vụ mùa năm 2014
+ Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô 1 giống, các tổ hợp được bố trí tuần tự không nhắc lại, mỗi giống cấy 5 m2
+ Khoảng cách: Hàng cách hàng 20 cm, cây cách cây 11 cm, cấy 1 dảnh. + Mật độ cấy: 45 cây/m2
+ Kỹ thuật trồng và chăm sóc:
- Cày bừa, làm giầm đất, nhặt cỏ sách sẽ, san phẳng ruộng. - Gieo mạ, gieo theo đúng luống, ô.
- Bón phân: Bón phân, chăm sóc nhưđại trà: Lượng bón: 120kg N + 90kg P2O5 + 60kg K2O /ha Cách bón:
+ Bón lót: 100% P2O5 + 20% N sau lần bừa cuối cùng, giữ mực nước thấp. + Bón thúc lần 1: 50% N + 40% K2O thúc đẻ nhánh kết hợp làm cỏ sục bùn, giữ mực nước 12 cm.
+ Bón thúc lần 2: toàn bộ lượng phân còn lại , bón vào lúc bước vào giai
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
- Làm cỏ: Trộn thuốc trừ cỏ với đạm qua các lần bón phân.
- Phun thuốc: Phun 2 giai đoạn, phòng trừ sâu đục thân, cuốn lá và bệnh khô vằn. Phòng trừ kịp thời khi thấy xuất hiện dấu hiệu bệnh.
2.3.2.2. Chọn lọc các cá thể tốt
Để chọn lọc được các cá thể tốt mang gen kháng bệnh bạc lá, trước tiên ta phải chọn được các cá thể có đặc điểm nông sinh học tốt và năng suất cao. Chọn lọc cá thể tốt được tiến hành qua 3 giai đoạn:
*Giai đoạn đẻ nhánh: Chọn 30 cá thể dựa vào khả năng đẻ nhánh (không chọn những cây ở hàng ngoài) của các cá thể trong mỗi tổ hợp. Chọn những cá thể
sinh trưởng phát triển tốt, đẻ nhánh tập trung, có 6-8 nhánh trở lên, các nhánh đều to, các cá thể xung quanh của cá thể được chọn còn nguyên, không bị sâu bệnh. Cắm thẻ theo dõi và tiến hành thu mẫu từng cá thểđể tách chiết DNA.
*Giai đoạn trỗ: Từ những cá thể cắm thẻ theo dõi, chọn ra những cá thể trỗ đều, có 6 – 7 nhánh hữu hiệu trở lên ở lúa tẻ hoặc 4 – 6 nhánh hữu hiệu trở lên ở lúa nếp, thời gian trỗ ngắn, không nhiễm sâu bệnh. Giai đoạn này chọn 15 – 20 cá thể.
*Giai đoạn chín: Tiếp tục chọn ra những cá thể tốt nhất, có it nhất 4 - 6 bông hữu hiệu/ khóm, chín sớm, năng suất cao, số hạt chắc/bông đạt 150 - 200 hạt trở lên, không nhiễm sâu bệnh, gạo trong không bị bạc bụng. Chọn 10 – 15 cá thể tốt.
Sau khi có kết quả theo dõi một sốđặc điểm nông sinh học, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các cá thể đánh dấu, tiến hành chọn lọc cá thể tốt bằng phương pháp chọn lọc cá thể mang gen kháng bệnh bạc lá và mang gen thơm bằng chỉ thị phân tử DNA.
2.3.2.3. Phương pháp đánh giá một sốđặc điểm nông sinh học cơ bản
Các đặc điểm nông sinh học được khảo sát theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá cây lúa của IRRI, 2002”
Xác định thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng - Từ cấy đến bắt đầu trỗ
- Từ trỗđến chín
Sau đó tính tổng thời gian sinh trưởng từ ngày gieo đến ngày lúa chín hoàn toàn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
cao cây cuối cùng, Đo chiều dài, chiều rộng hạt thóc
Đặc điểm nông sinh học thời kỳ chín liên quan đến năng suất: Số bông hữu hiệu/khóm, số hạt chắc/bông, khối lượng 1000 hạt, năng suất tiềm năng
- Năng suất tiềm năng = A x B x C x D x 10-4 Trong đó: A: Số khóm/m2 (45 khóm/m2) B: Số bông hữu hiệu/khóm C: Số hạt chắc/bông chính D: Khối lượng 1000 hạt Với mỗi giai đoạn quan sát, tiến hành lập bảng.
Cụ thể hiện nay các chỉ tiêu theo dõi được tiến hành theo QCVN 01- 56:2011/Bộ NNPTNT:
+ Thời gian sinh trưởng: Tổng số ngày từ khi gieo đến lúc hạt chín (85% số
hạt trên bông đã chín).
+ Số nhánh tối đa trên khóm: Đếm số nhánh trong giai đoạn lúa vươn lóng làm đòng.
+ Số nhánh hữu hiệu/ khóm: Số nhánh có khả năng tạo thành, theo dõi giai
đoạn trỗ.
+ Chiều cao cuối cùng: đo từ gốc đến đầu mút bông không kể râu, đo giai
đoạn chín sữa đến khi chin sáp.
+ Số bông hữu hiệu/khóm: số bông có từ 10 hạt chắc trở lên.
+ Số hạt/bông, số hạt chắc, tỷ lệ hạt chắc/bông: theo dõi 3 bông/cá thể. + Cân năng suất cá thể: khối lượng của tất cả các hạt chắc trên cá thể.
2.3.2.4. Phương pháp đánh giá cảm quan mùi thơm
Theo Sood và Siddiq, 1978, mùi thơm được đánh giá cảm quan như sau: Mùi thơm trên lá
Thu 10 lá của mỗi mẫu tổ hợp lai ở giai đoạn lúa đẻ nhánh rộ. Lấy 1g lá, cắt thành những đoạn dài 5 mm, bỏ vào ống nghiệm, ngâm với 5ml dung dịch KOH 1,7%, đậy nắp lại và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Mức độ thơm được chấm
điểm theo 3 mức rồi lấy trung bình.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
Mùi thơm của gạo
Lấy 10 hạt của mỗi tổ hợp lai, vừa mới thu hoạch, bóc vỏ, làm trắng rồi nghiền nhỏ. Bột gạo của mỗi tổ hợp lai được cho vào một ống chứa 500µl KOH 1,7%, đậy nắp và đểở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đánh giá mùi thơm cũng bằng phương pháp ngửi cảm quan rồi cho điểm như trên.
2.3..3 Thí nghiệm trong phòng
2.3.3.1. Phương pháp tách chiết DNA
Quy trình chiết tách DNA theo Phan Hữu Tôn, 2000 và Zheng và cộng sự, 1995 gồm các bước sau :
Bước 1: lá cây khỏe thu vào buổi sáng, cắt dài khoảng 2cm bỏ vào ống nghiệm có dung tích dài 1.5ml, đánh dấu tên tổ hợp lai bỏ vào đá lạnh .
Bước 2: Trong phòng thí nghiệm các cối chày sứ đã được khử trùng đặt trong đá lạnh, các mẫu lá được cắt nhỏ khoảng 0.5cm vào cối sứ .
Bước 3: nhỏ 400µl dung dịch chiết tách DNA vào cối sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫu lá cho đến khi dịch chiết chuyển sang màu xanh đen .
Bước 4: nhỏ thêm 400µl dung dịch chiết tách DNA vào, trộn đều và chuyển dung dịch này vào ống nghiệm đã đánh dấu cùng giống .
Bước 5: cho vào ống nghiệm 400µl dung dịch hỗn hợp Phenol : chloroform : Isolamyl alchohol (25:24:1). Sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút ở
nhiệt độ 40C rồi chuyển phần dung dịch phía trên sang ống nghiệm được đánh dấu cùng tổ hợp lai. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 6: cho thêm 400µl dung dịch chloroform: Isolamyl alchohol (24:1) sau
đó ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong vòng 3 phút rồi chuyển phần dung dịch phí trên sang ống nghiệm đã được đánh dấu cùng tổ hợp lai.
Bước 7: Cho 800µl ethanol 96% trộn đều sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 40C, đổ phần dung dịch phía trên giữ lại phần kết tủa dưới
đáy ống nghiệm .
Bước 8: Rửa kết tủa bằng ethanol 70% và để khô tự nhiên bằng cách úp ngược
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
Bước 9: hòa tan kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ 40C và sử dụng 1µl cho phân tích PCR.
2.3.3.2. Thành phàn các dung dịch tham gia chiết tách
Bảng 2.2. Thành phần dung dịch chiết tách Thành phần Nồng độ dd mẹ Nồng độ dd làm việc Hỗn hợp 50ml dd chiết tách Tris-HCl pH=8 1M 50mM 2,5ml EDTA pH=8 0.5M 0.25mM 2,5ml NaCl 5M 300mM 3,0ml SDS 10% 1% 5,0ml H2O 37,0ml Bảng 2.3. Thành phần dung dịch TE Thành phần Nồng độ dd mẹ Nồng độ dd làm việc Thể tích 50ml Tris-HCl 1M 10mM 0,5ml EDTA 0.5M 1mM 0,1ml H2O 49,4ml
2.3.3.3. Kỹ thuật PCR dùng trong phát hiện gen kháng bệnh bạc lá và gen mùi thơm
Quy trình phản ứng PCR: sau khi cho đủ các thành phần phản ứng và DNA cần nhân vào ống PCR (các ống này được đánh số theo thứ tự) sau đó cho vào trong máy nhân gen để chạy phản ứng PCR. Đặt chu kì nhiệt cho phản ứng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
a, Kỹ thuật PCR dùng trong phát hiện gen kháng bệnh bạc lá
Quy trình PCR xác định gen kháng bệnh bạc lá do GS.TS.S. Taura và cộng sựđề xuất. Bảng 2.4. Thành phần cho 1 phản ứng PCR phát hiện gen kháng bạc lá STT Thành phần Nồng độ gốc Thểlấ tích cy(µl) ần 1 H2O 13,3 2 PCR buffer (có chứa Mg2+) 10X 2,0 3 dNTPs 2,5mM 1,6
4 Primer Forward 10 pmol/µl 1,0
5 Primer Reverse 10 pmol/µl 1,0
6 DNA taq polymerase 5unit/µl 0,1
7 Tổng thể tích cocktail 19,0
8 DNA mẫu 1 µl 1,0
9 Tổng thể tích 20 (µl)
Nếu PCR không chứa Mg2+ thì phải bổ sung thêm Mg ở nồng độ cuối cùng bằng 0.5- 1.5 mM.
Bảng 2.5. Các Primer dùng trong PCR phát hiện gen kháng bạc lá lúa
Gen KH mồi NST Trình tự mồi cách cM Khoảng Tác giả
Xa4 MP2 11 F: 5’ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG 3’ R: 5’GTG CTA TAA AAG GCA TTC GGG 3’ 1.7cM N. Furuya et al, 1992
Xa7 P3 6 F 5’ CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT 3’
R 5’ CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA 3’. 2.5 cM
Taura và cs. (2004)
- Chu trình PCR nhân gen
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước Tác dụng Nhiệt độ ( 0C ) Thời gian Số chu kỳ
1 Biến tính 94 2 phút 1 2 Biến tính 94 30s 34 Gắn mồi 58 30s Tổng hợp 72 30s 3 Biến tính 72 5 phút 1 4 Bảo quản 4 - Chạy điện di sản phẩm xác định gen kháng bạc lá lúa :
Sau khi kết thúc phản ứng PCR tiến hành điện di sản phẩm nhân gen đối với gen Xa4 và Xa7 bằng agarose 1,5%.
- Chuẩn bị gel agarose 1,5%: Cân 1,5g agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun sôi đến khi tạo gel agarose trong suốt. Để gel nguội đến nhiệt độ
khoảng 500C, đổ vào khuôn và để gel cứng lại trong 15 phút. - Chạy điện di :
+ Trộn 9µl sản phẩm PCR với 1µl Loading buffer 10X, nhỏ hỗn hợp vào giếng agarose.
+ Chạy điện di ở 100V, 110mA trong khoảng 25 phút .
- Sau khi chạy điện di xong nhuộm sản phẩm DNA trong gel agarose bằng