mercaptoethanol
Phương pháp SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) trên bề mặt sẽ tích hoàn toàn điện tích âm (1 phân tử SDS sẽ liên kết với 2 gốc acid amin). Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực âm của điện trường. Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết.
Hình 9. Sự phân tách protein bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE
(* Nguồn: http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/proteins_purification.html)
Hệ thống gel được sử dụng rộng rãi nhất để tách một loạt các protein bằng điện di SDS-PAGE là hệ thống Laemmli (1970) trong đó sử dụng tris-glycine gel bao gồm
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
một thành phần gel tập trung (được sử dụng để giúp tập trung các protein thành các băng sắc nét ở vạch xuất phát khi chạy điện di) thông thường có nồng độ gel thấp vào khoảng 4-5%, do đó có kích thước lỗ gel lớn giúp tập trung các protein trong giếng về cùng một vạch xuất phát (hình thành nên một lớp băng màu mỏng nằm ngay phía trên lớp gel phân tích) và một lớp gel phân tích có nồng độ cao hơn khoảng 6 - 15% được sử dụng để tách protein dựa trên trọng lượng, khối lượng phân tử của chúng. Hệ thống cổ điển này sử dụng một hệ thống đệm không liên tục mà độ pH và lực ion của bộ đệm sử dụng để chạy gel (Tris pH 8,3) là khác nhau gel tập trung (Tris pH 6,8) và gel phân tích (Tris pH 8,8).
2.3.4. Một số phƣơng pháp khác 2.3.5.1. Phƣơng pháp Bradford
Sử dụng thuốc nhuộm Coomassie G-250 là một thuốc thử màu để phát hiện và định lượng protein đã được mô tả đầu tiên bởi tiến sĩ Marion Bradford năm 1976 (Bradford, 1976). Thermo Scientific Pierce Coomassie và Coomassie Plus ProteinAssay Product là các biến thể của thuốc thử đầu tiên được báo cáo bởi Bradford.
Protein được định lượng bằng phương pháp Bradford là protein tan trong dung dịch. Vì vậy, muốn xác định hàm lượng protein một mẫu ta phải trích ly protein. Hàm lượng protein xác định sẽ phụ thuộc vào hiệu quả trích ly (khả năng hòa tan của protein trong dung môi trích ly).
Nguyên tắc:
Phản ứng protein với thuốc thử Bradford được thực hiện trong môi trường acid mạnh. Phương pháp này dựa trên sự biến đổi độ hấp thụ ánh sáng (OD) của Coomassie Blue trong tương tác với protein. Bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc thử trong khoảng từ 465nm đến 595nm khi Coomassie Blue liên kết với protein. Protein ổn định mang điện tích âm liên kết với Coomassie Blue qua tương tác kỵ nước và liên kết ion (tương tác chủ yếu qua các gốc acid amin như arginin và mức thấp hơn là histidine, lysine, tyrosine, tryptophan…). Số lượng các hợp chất của thuốc nhuộm Coomassie liên kết với mỗi phân tử protein tỷ lệ thuận với số điện tích dương được tìm thấy trên protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là Bovine Serum Albumin (BSA). Dựa vào đường chuẩn của protein suy ra hàm lượng protein trong mẫu.
Hình 10. Minh họa phản ứng của Coomassie G-250 với protein
(*Nguồn:http://www.qcbio.com/pierce/23236.htm)
Các acid amin tự do, các peptide và protein có trọng lượng phân tử thấp không tạo ra màu sắc khi nhuộm với thuốc thử Coomassie. Nhìn chung, khối lượng của một peptide hoặc protein phải có ít nhất 3000 dalton mới được phát hiện với thuốc thử này. Phương pháp này dùng cho Protein tan trong nước, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng. Phương pháp này nhạy hơn 2-3 lần so với phương pháp Lowry, nhanh và đơn giản hơn nhiều vì nó cho phép xác định tới vài µg protein/ml, đồng thời làm giảm ảnh hưởng của muối, đệm, các chất khử…Tuy nhiên phương pháp này không dùng với những chất có chứa surfactant vì gây kết tủa của các chất phản ứng. Những chất có tính kiềm mạnh làm tăng mật độ quang gây sai lệch kết quả. Màu của Coomassie làm bẩn cuvet thạch anh nên chỉ dùng cuvet thủy tinh để đo mật độ quang. (http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-cac-phuong-phap-dinh-luong-protein-52844/)
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
2.3.5.2. Phƣơng pháp Nelson Somogyi
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử. Khi enzyme của vi khuẩn phân cắt CMC cho ra các gốc đương khử, đường khử sẽ bị oxi hóa bởi dung dịch Cu2+ khi đun nóng tạo thành Cu+ tạo kết tủa đỏ gạch sau đó Cu+ được oxy hóa trở lại thành Cu2+ sử dụng một phức hợp không màu hetero- polymolybdate trong quá trình khử dung dịch cho màu xanh đặc trưng. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định và được tiến hành đo ở bước sóng 520nm. Kết hợp với đồ thị đường chuẩn của glucose với thuốc thử sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Phương pháp Nelson-Somogyi sử dụng một phức hợp arsenomolybdate hình thành bởi phản ứng của amoni molybdat, (NH4)6Mo7O24, với natri asenat Na2HAsO7.
2.3.5.3. Phƣơng pháp định tính bằng đƣờng kính vòng tròn thủy phân
Nguyên tắc: Congo red liên kết với cầu nối β-1-4-glycoside trên CMC tạo màu đỏ trên bề mặt môi trường khi nhuộm và không bị rửa trôi bởi dung dịch NaCl. Khi liên kết này bị cắt bởi endoglucanase, congo red không còn tiếp tục bám và bị rửa trôi.
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Trong nước ta, đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về tinh sạch cellulase nói chung hay endoglucanase nói riêng trên vi khuẩn Bacillus được công bố. Các nghiên cứu trong nước chủ yếu chỉ tập trung vào cellulase thu nhận từ nấm.
Trịnh Đình Khá và ctv. (2007), tinh sạch sơ bộ và đánh giá tính chất hoá lý của cellulase từ chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sau khi tủa bằng 95% acetone hoặc ethanol cho hiệu suất thu hồi cao (69 - 52%) enzyme thu được có hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ 60oC và pH 4,5.
Trần Thạnh Phong và ctv. (2007), thu nhận enzyme cellulase của Trichoderma reesei trên môi trường bán rắn với cơ chất bã mía kết hợp với cám mì. Hoạt tính và hiệu suất sinh tổng hợp cellulase là 280,64 IU/g và FPU (Filter Paper Unit) là 5 IU/g.
Nghiêm Ngọc Minh và ctv. (2008), Nghiên cứu đặc điểm phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng vi khuẩn chịu nhiệt BSS2 phân lập tại bãi rác Nam Sơn –
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Hà Nội. Kết quả hoạt tính enzyme thu được là 0,138 U/ml với endo-β-1,4-glucanase và 0,07 U/ml với exo-β-1,4-glucanase.
Nghiêm Ngọc Minh và ctv. (2006), Nghiên cứu phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS2. Kết quả, chủng XKS2 có hoạt tính endo- β-1,4-glucanase là 0,93 mg/ml trên môi trường rắn, 0,21 mg/ml trên môi trường dịch thể, exo-β-1,4 glucanase 0,22 mg/ml trên môi trường rắn và 0,102 mg/ml trên môi trường dịch thể.
2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc
Các nghiên cứu về tinh sạch endoglucanase trên các dòng Bacillus subtilis hiện vẫn còn rất hạn chế.
Aa et al. 1994 đã khảo sát khả năng sinh enzyme và đặc tính của endo-beta-1,4- glucanase từ Bacillus subtilis CK-2 phân lập từ phân hữu cơ trong đất. Kết quả hoạt tính cao nhất của enzyme thu được ở khoảng pH tối ưu 5,6-5,8 và nhiệt độ tối ưu 65oC. Enzyme tinh sạch bằng SDS-PAGE với trọng lượng phân tử 35,5 kDa và sắc ký lọc gel Sephadex G-75 vởi trọng lượng phân tử 70 kDa.
Baba et al. (2005) tinh sạch và khảo sát hoạt tính của endo-1,4-beta-D-glucanase mới từ Beltraniella portoricensis, với trọng lượng phân tử enzyme sau khi tinh sạch là 40 kDa được xác định bằng phương pháp SDS-PAGE, pH tối ưu là 4,5 và nhiệt độ tối ưu là 55o
C.
Bischoff et al. (2006) đã tinh sạch và khảo sát hoạt tính của endoglucanase từ loài vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus licheniformis với hoạt tính đặc hiệu 183 (U/mg), hiệu suất tinh sạch 17%.
Sadhu et al. 2013 đã tinh sạch và khảo sát hoạt tính, khả năng sinh endoglucanase từ chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ phân bò. Kết quả endoglucanase được tinh sạch gấp 8,5 lần so với dịch enzyme thô ban đầu, hiệu suất tinh sạch 68,1%, nhiệt độ tối ưu 50oC, pH tối ưu 7, trọng lượng phân tử protein thu được qua SDS-PAGE là 97 kDa.
Vijayaraghavan et al. (2011) cũng đã có báo cáo về kết quả tinh sạch carboxymethyl cellulase (Endoglucanase) từ một chủng Bacillus, được phân lập từ ruộng lúa. Kết quả enzyme được tinh sạch có hoạt tính đặc hiệu 246U/mg, độ tinh sạch
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
là 14,5 lần, trọng lượng phân tử là 58 kDa được xác định bằng phương pháp SDS- PAGE.
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian: từ 7/2014 đến 12/2014
Địa điểm: Phòng Công nghệ Enzyme, Phòng Sinh hóa, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Các thiết bị sử dụng bao gồm: Hệ thống điện di Mini protean (Bio Rad), hệ thống sắc ký (Bio Rad), tủ ủ vi sinh vật Memmert, tủ cấy vô trùng Esco, máy đo quang phổ máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417R, máy lắc ủ Eppendorf (Đức), bếp đun cách thủy Prolabo…,
Các dụng cụ sử dụng bao gồm đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, cốc thuỷ tinh hoặc nhựa, chai lọ thuỷ tinh, eppendorf, bộ micropipette Biorad…,
3.1.3. Nguyên vật liệu
Dòng vi khuẩn DD9 đồng hình với Bacilus subtilis RC24 ở mức độ 94% được lưu trữ tại Phòng Sinh hóa, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Bã mía thu được từ nhà máy đường Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang sẽ được sấy ở 70oC trong 180 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu Retsch Miihle với kích thước lỗ lưới là 0,2 mm, xử lý lignin, rửa lại với nước lọc nhiều lần.
3.1.4. Hóa chất
Natri clorua (NaCl) (Trung Quốc), Magnesium sulfate (MgSO4) (Trung Quốc),
Dipotassium phosphate (K2HPO4) (Trung Quốc), Monopotassium phosphate
(KH2PO4) (Trung Quốc), Ammonium sulfate (NH4SO4) (Trung Quốc), Bovin Serum Albumin (Merck), Tris, β-mercaptoethanol (Merck), Acrylamide (Bio Rad), Sodium hydroxide (NaOH) (Trung Quốc), Sodium Dodecyl Sulfate (Merck), Bromophenol blue, Acetic acid (CH3COOH) (Trung Quốc), Hydrochloric acid (HCl) (Trung Quốc), CMC (Merk), congo Red (Merk), thuốc thử Nelson, thuốc thử Bradford, Glucose,
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Glycerol, Commassie blue G250, Glycine, Methanol, Ammonium persulfate, Tetramethylethylenediamine.
Gel trao đổi ion âm: Uno-Sphere Q.
Dung dịch protein chuẩn có trọng lượng phân tử trong khoảng 14,4 đến 116 kDa (Fermantas).
3.1.5. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật Môi trƣờng đặc Ryckeboer (2003) cải tiến
Bảng 1. Thành phần môi trƣờng cải tiến (M1)
(* Nguồn: Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh et al., 2010)
Môi trƣờng lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến
Bảng 2. Thành phần môi trƣờng cải tiến (M2)
Tên hóa chất Khối lƣợng/ Thể tích
Bột bã mía 10gram (NH4)2SO4 1gram KH2PO4 1gram K2HPO4 1gram MgSO4.7H2O 0,5gram NaCl 0,001gram Nước cất 1000 ml
(* Nguồn: Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh et al., 2010)
Tên hóa chất Khối lƣợng/Thể tích
Bột bã mía 10 gram (NH4)2SO4 1 gram KH2PO4 1 gram K2HPO4 1 gram MgSO4.7H2O 0,5 gram NaCl 0,001 gram Agar 20 gram Nước cất 1000 ml
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp kết tủa
3.2.1.1. Kết tủa phân đoạn endoglucanase với Ammonium Sulfate (AS) bãohòa
Mục đích: Chọn nồng độ ammonium sulfate thích hợp cho quá trình thu hồi enzyme
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố AS với 6 mức 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% AS bão hòa.
Tiến hành thí nghiệm: Dịch trích enzyme thô được tủa phân đoạn với AS nồng độ 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% AS bão hòa. Mỗi phân đoạn lần lượt được ly tâm 6000 vòng/20 phút, thu tủa hòa tan trong đệm Tris HCl 200mM pH 7, thẩm tích ở 4oC trong 24 giờ .
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp vòng tròn đường kính thủy phân
3.2.1.2. Kết tủa endoglucanase với ethanol
Mục đích: Chọn loại dung môi hữu cơ tối ưu và tỷ lệ trích ly thích hợp cho quá trình thu hồi enzyme
Bố trí thí nghiệm: Tỷ lệ dung dịch enzyme: ethanol (4oC) là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 Tiến hành thí nghiệm: Tiến hành tủa dịch trích enzyme thô với ethanol trong tủ lạnh -20oC theo tỷ lệ như đã bố trí ở trên, ly tâm 6000 vòng/20phút ở 40C loại bỏ dịch trong thu tủa, mở nắp để 30 phút cho ethanol bay hơi, hòa tan tủa trong dung dịch đệm Tris HCl 200mM pH 7
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
3.2.1.3. Kết tủa endoglucanase với acetone
Mục đích: Chọn loại dung môi hữu cơ tối ưu và tỷ lệ trích ly thích hợp cho quá trình thu hồi enzyme
Bố trí thí nghiệm: Tỷ lệ dung dịch enzyme: acetone (-20oC) là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 Tiến hành thí nghiệm: Tiến hành tủa dịch trích enzyme thô với acetone trong tủ lạnh - 20oC theo tỷ lệ như đã bố trí ở trên, ly tâm 6000 vòng/20phút ở 4oC loại bỏ dịch trong thu tủa, hòa tan tủa trong dung dịch đệm Tris HCl 200mM pH 7
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp vòng tròn đường kính thủy phân
3.2.2. Tinh sạch endoglucanase bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion
Mục đích: Tách endoglucanase ra khỏi các tạp chất khác dựa vào điện tích bề mặt của protein
Tiến hành thí nghiệm:
a. Chuẩn bị gel: Cân 10 gram gel Uno – Sphere Q cho vào cốc chứa dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75 ngâm 1-2 ngày ở nhiệt độ phòng, rửa gel bằng dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75. Lặp lại quá trính rửa 2 lần.
b. Nhồi gel vào cột: Nhồi gel vào cột sắc ký (2,5x10cm). Cân bằng cột bằng dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75 (3 lần thể tích cột). Tốc độ dòng chảy 1ml/phút.
c. Bơm mẫu: 20ml dung dịch protein được giữ lại ở thí nghiệm 1 được bơm vào cột với tốc độ 1 ml/phút.
d. Rửa cột: Cột được rửa bằng dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75, theo dõi quá trình rửa cột qua sắc ký đồ đến khi protein không bám được đẩy ra hết khỏi cột. Tốc độ dòng chảy là 1 ml/phút.
Thu phân đoạn protein không bám.
e. Rửa giải enzyme: Rửa giải bằng gradient nồng độ muối NaCl từ 0M-1M, trong dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 8,75, tốc độ dòng chảy 1 ml/phút. Thu các phân đoạn bằng máy sắc ký.
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học
Mỗi phân đoạn được tiến hành thẩm tích trong dung dịch đệm Tris-HCl 200mM pH 7 trong 24 giờ ở 4oC.
Chỉ tiêu đánh giá:
Hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Hoạt tính enzyme bằng phương pháp vòng tròn đường kính thủy phân
Định lượng hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944)
Xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của endoglucanase bằng phương pháp SDS-PAGE
___________________________________________________________________________________________________ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học